照序列进行比对。所 有序列都符合相应的参照序列。所得重组沙门菌菌株命名为VXM06 (携带pVAXIO. hWTl质 粒的沙门菌Ty21a)和VXM06m(携带pVAXIO. mWTl质粒的沙门菌SL7207)。
[0130] 实施例3 :在同系白血病小鼠樽铟中评价VXM06和VXM06m的抗肿瘤活件
[0131] 在同系白血病C57/BL6J小鼠模型中经过43天评价VXM06和VXM06m的效能（隔日 剂量给予，共4次，并在第17天接种白血病细胞）。两组雄性小鼠，每组10只（η = 10)，分 别以K^CFU/次的剂量接受VXM06 (伤寒沙门菌Ty21a，含有可编码截短的人WT1的pVAXIO. hWTl)或VXM06m(伤寒沙门菌，含有可编码截短的鼠 WT1的pVAXIO. mWTl)。类似构成的对 照组给予VXM0m_empty (不含表达质粒的伤寒沙门菌载体对照），剂量与处理组相同。本研 究中，进行体重、死亡率和存活率测定。正式实验之前，使用5. 0X106和3. 0X10 7个FBL-3 细胞在未接种疫苗的雄性C57B16小鼠（每组η = 5)中进行14天的预实验，然后得出前一 个细胞浓度为用于正式疫苗实验中优选的。
[0132] DNA 痔苗：
[0133] 将VXM06、VXM06m和不含表达质粒的伤寒沙门菌空载体（VXM0m_empty)储存在 彡-80°C备用。接种中使用的小瓶不再冷冻，而是随后弃掉。研究中所用DNA疫苗的特征见 下表3:
[0135] 给药路径:
[0136] 每只动物每次施用100 μ 1 VXM0m_empty、VXM06m和VXM06。测试项目融化后，在 30min之内施用。所用测试项目通过插管经口腔灌胃（经口，P. 0)给予，注射体积为100 μ 1/ 小鼠。
[0137] 不考虑动物分组，每只动物接受前剂量施用缓冲剂以中和胃中的酸性介质，然后 给药（对所有剂量组给予100 μ 1/动物/施用）。所述缓冲剂含2. 6g碳酸氢钠、1. 7g L-抗 坏血酸、0. 2g乳糖一水合物和100ml饮用水。施用所述测试项目之前，进行前剂量施用多达 30分钟。
[0138] 细朐培养物:
[0139] 过表达WT1的小鼠白血病细胞FBL-3需要传代以保证存活率及获得所需量的细 胞。
[0140] 收集指数生长期的肿瘤细胞，将其与台盼蓝混合（以建议稀释度1:1)用于存活 率测定，并通过光学显微镜使用计数板手动计数。将FBL-3细胞洗涤并重悬于不含血清的 RPMI介质中用于注射进入C57BL/6小鼠。
[0141] 痔苗和肿瘤细朐接种:
[0142] 腹膜内（I.P.)注射的细胞注射条件：细胞存活率彡97% ;5. 0X106个细胞 /500 μ 1/小鼠。
[0143] 将动物（30只C57BL/6小鼠，4-6周龄，雄性，~20g每只，Charles River, France)编号，给予独特的动物标识耳部切口标记，每周两次体重测量。
[0144] 每 10 只小鼠 （η = 10 雄性）用 VXM0m_empty、VXM06m 和 VMX06 接种。在第 1、3、5 和7天，通过K^CFU/施用经口腔灌胃接种疫苗。第17天，通过I.P.路径将FBL-3肿瘤细 胞接种到小鼠中。实验设计简述见下轰1:
[0146] 结果：
[0147] 3个处理中的存活率数据见下表5:
[0148]
[0150] 每天临床检查所有动物，包括：行为、患病症状（恶病质、进展中及移动或饮食困 难）。
[0151] 肿瘤挑战后动物死亡数见下表6:
[0152]
[0153] 图4示出了用VXM0m_empty、VXM06m和VXM06处理患有FBL-3白血病小鼠的 Kaplan-Meier存活曲线。与对照小鼠相比，使用VXM06m和VXM06处理的小鼠可存活更久 (长达26天）。约40% VXM06m和VXM06处理的小鼠可比VXM0m_empty处理的小鼠存活更 久。3个测试组存活率的平均倌和中倌见下表7:
[0154]
[0155] 图5示出了 VXM0m_empty、VXM06m和VXM06处理患有FBL-3白血病小鼠的平均存 活率。与对照小鼠相比，使用VXM06m和VXM06处理的小鼠可存活更久。
[0156] 该实验显示VXM06和VXM06m构建体靶向小鼠模型中WT1过表达白血病细胞的效 果。用空载体处理的对照小鼠在肿瘤细胞接种后最多存活16天（见图4)。但是，VXM06m 或VXM06处理的小鼠显示出与对照载体VXM0m_empty免疫的小鼠相比延长的存活率（两种 测试项目都可长达26天）。约40 % VXM06m或VXM06处理的小鼠比用VXM0m_empty处理的 对照组存活更久。
[0157] 总之，VXM06m和VXM06在同系C57B16白血病小鼠模型中显示出对测试动物存活率 的药效。与空载体相比，VXM06m和VXM06两种化合物显示出相似的药效。所述结果表明， 本发明的疫苗能够在具有免疫能力的小鼠白血病模型中启动针对WT1的应答，导致与空载 体处理的动物相比更久地存活。
【主权项】
1. 一种沙门菌减毒突变株，其包含至少一个拷贝的含有编码肾母细胞瘤蛋白I(WTl) 表达盒的重组DNA分子。2. 如权利要求1所述的沙门菌减毒突变株，其中所述沙门菌减毒突变株是肠炎沙门菌 种，特别地，其中所述沙门菌减毒突变株是伤寒沙门菌Ty 21 a。3. 如权利要求1或2所述的沙门菌减毒突变株，其中所述表达盒是真核表达盒。4. 如权利要求1到3任一项所述的沙门菌减毒突变株，其中WTl选自由人WTl和与其 具有至少80 %序列同一度的蛋白组成的组，特别地，其中WT1是截短的，更特别地，其中WT1 的锌指结构域是缺失的，最特别地，其中所述截短的WTl的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 不。5. 如权利要求3或4所述的沙门菌减毒突变株，其中所述重组DNA分子包含卡那霉素 抗生素抗性基因、PMBlori和受CMV启动子控制的编码人WTl或与其具有至少80%序列同 一度的蛋白尤其是截短的人WTl的真核表达盒。6. 如权利要求1到5任一项所述的沙门菌减毒突变株，其可用作药剂。7. 如权利要求6所述的沙门菌减毒突变株，其可用作疫苗。8. 如权利要求7所述的沙门菌减毒突变株，其可用于癌症免疫治疗。9. 如权利要求8所述的沙门菌减毒突变株，其中癌症免疫治疗还包括施用包含至少一 个拷贝的含有编码肿瘤抗原和/或肿瘤间质抗原的表达盒的重组DNA分子的一种或多种另 外的沙门菌减毒突变株，特别地，其中所述一种或多种另外的沙门菌减毒突变株是包含真 核表达盒的伤寒沙门菌Ty21a，更特别地，其中所述一种或多种另外的沙门菌减毒突变株包 含编码人VEGFR-2的沙门菌减毒突变株，更特别地，其中所述一种或多种另外的沙门菌减 毒突变株包含名为VXMOl的沙门菌减毒突变株。10. 如前述任一项权利要求所述的、特别是权利要求9所述的沙门菌减毒突变株，其中 所述沙门菌减毒突变株与所述一种或多种另外的沙门菌减毒突变株共同施用。11. 如权利要求8到10任一项所述的沙门菌减毒突变株，其中癌症免疫治疗伴随化学 疗法、放射疗法或者生物学癌症疗法，特别地，其中所述沙门菌减毒突变株是在所述化学疗 法或放射疗法治疗周期之前或其过程中、或者在生物学癌症疗法之前或其过程中、或者在 所述化学疗法或放射疗法治疗周期或生物学癌症疗法之前或其过程中施用的。12. 如权利要求6到11任一项所述的沙门菌减毒突变株，其中所述沙门菌减毒突变株 是经口施用的。13. 如权利要求8到12任一项所述的沙门菌减毒突变株，其中所述癌症选自白血病，特 别地选自急性髓样白血病（AML)和急性淋巴样白血病（ALL)，以及选自实体瘤，特别地选自 肺癌、乳癌、食管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、胆管导管癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、头颈部 癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横 纹肌肉瘤、前列腺癌。14. 如权利要求6到13任一项所述的沙门菌减毒突变株，其中单剂量从约10 5到约 1011，特别地从约IO6到约101°,更特别地从约IO 6到约10 9,更特别地从约IO6到约10 8,最特 别地从约IO6到约10 7菌落形成单位（CFU)。15. 如权利要求8到14任一项所述的沙门菌减毒突变株，其可用于个性化癌症免疫治 疗，所述治疗包括评估患者的肿瘤抗原表达模式和/或间质抗原表达模式的步骤。
【专利摘要】本发明涉及含有编码肾母细胞瘤蛋白1的重组DNA分子的沙门菌减毒突变株。具体地，本发明涉及所述沙门菌减毒突变株在癌症免疫疗法中的用途。
【IPC分类】A61K39/112, C12R1/42, A61K35/74, A61P35/00, C12N1/36, C07K14/47, A61K48/00
【公开号】CN105246496
【申请号】CN201480023775
【发明人】海因茨·尤贝瑙诺, 马尔科·施普林格
【申请人】万科斯蒙股份有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年4月24日
【公告号】CA2910213A1, EP2988762A1, US20160068801, WO2014173542A1