测定肉毒杆菌神经毒素的生物活性的手段和方法
【专利说明】测定肉毒杆菌神经毒素的生物活性的手段和方法
[0001] 本发明涉及用于测定神经毒素活性的手段以及方法。具体地，本发明涉及编码融 合多肽的多核苷酸以及由本发明的多核苷酸编码的融合多肽，所述融合多肽包括由包括神 经毒素切割位点的接头隔开的（i)转录因子结构域和（ii)胞质滞留结构域。还包括包含 本发明多核苷酸的载体和包含本发明的多核苷酸、载体或融合多肽的宿主细胞。此外，还包 括用于测定样品中的神经毒素活性的方法。此外，本发明涉及本发明的多核苷酸、载体、融 合多肽或宿主细胞在测定样品中的神经毒素活性中的应用。最后，本发明涉及一种用于测 定神经毒素活性的包含本发明的多核苷酸、载体、融合多肽或宿主细胞的试剂盒。
[0002] 肉毒杆菌（Clostridium botulinum)和破伤风梭菌（Clostridium tetani)产生 高效的神经毒素，即分别为肉毒毒素（BoNT)和破伤风毒素（TeNT)。这些梭菌神经毒素特异 性地结合神经细胞并破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kDa 的单链蛋白质。翻译后加工涉及二硫桥的形成，以及细菌蛋白酶的有限蛋白水解（切割）。 活性的二链神经毒素由通过二硫键连接的N-端约50kDa的轻链和约IOOkDa的重链两条链 组成。神经毒素在结构上由三个结构域组成，即催化轻链、包含易位结构域（N端的一半） 的重链和受体结合结构域（C端的一半），参见Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39 ; Krieglsteinl991, Eur. J. Biochem. 202, 41 ；Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49。
[0003] 肉毒杆菌分泌7种抗原性不同的血清型，被称为BoNT的A至G型。所有血清型和 由破伤风梭菌分泌的相关TeNT是通过剪切SNARE蛋白（尤其是SNAP-25)而封闭突触的胞 吐作用的锌（Zn 2+)-依赖的内切蛋白酶。尤其是，BoNT在肉毒中毒和破伤风中引起弛缓性 肌肉麻痹，参见 Fischer 2007, PNAS 104,10447。
[0004] 尽管其毒性作用，但BoNT已被用作大量疾病的治疗剂。在1989年BoNT血清型 A(BoNTA)被美国批准用于人的斜视、眼睑痉挛和其他疾病的治疗。它作为蛋白制剂是可商 购的，例如，以商品名BOTOX (Allergan Inc)，以商品名Dysport(Ipsen Ltd)。对于治疗性 应用，将复合物直接注射到待治疗的肌肉中。在生理PH下，毒素从蛋白复合物释放，并且产 生所希望的药理学效应。不含复合物蛋白的改进的BoNT/A制剂是以商品名XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)获得的。
[0005] BoNT在原则上减弱随意肌强度，因此，是斜视、包括颈肌张力障碍的灶性张力障 碍，以及良性自发性睑痉挛的有效治疗剂。它们已进一步显示出减轻单侧面部痉挛和局 限性痉挛，而且，对多种其他的适应症如胃肠病症、多汗以及美容除皱是有效的，参见Jost 2007, Drugs 67, 669〇
[0006] 生物活性的测定作为安全措施，用于质量控制和定量目的是很重要的。WO 95/33850描述了基于非竞争性测定法用于定量神经毒素的生物活性的方法。在这些方法 中，包括用于神经毒素的切割位点的底物结合到固相上。加入神经毒素导致底物的剪切。剪 切产物然后通过，例如，缀合到酶的特异性抗体而进行检测。这样的非竞争性测定法的一个 缺点是，所获得的测试结果可能是不均匀的，因此是不可靠的。
[0007] 已经开发的用于肉毒杆菌神经毒素的生物活性测定的进一步测定法涉及，例 如，中毒后动物的生存时间的测定，例如，"至死时间"（Lamanna C, Spero L, Schantz EJ: Dependence of time to death on molecular size of botulinum toxin. Infect. Immun. 1970, 1:423-4 ；Kondo H,Shimizu T,Kubonoya M，Izumi N，Takahashi M，Sakaguchi G:Titration of botulinum toxins for lethal toxicity by intravenous injection into mice.Jpn.J.Med.Sci.Biol. 1984,37:131-5 ； Boroff DA，Fleck U:Statistical analysis of a rapid in vivo method for the titration of the toxin of Clostridium botulinum. J. Bacteriol. 1966, 92:1580-1)，生物体的器官功 會^ 的抑制，如汗腺麻瘦（Ellies M:Experimental and clinical investigations on the inhibition of secretion of the major salivary glands with botulinum toxin A. Laryngorhinootologie 2003, 82:713-4 ;Monnier G，Tatu L，Parratte B，Cosson A,Michel F，Metton G: Sialorrhea, hyperhidrosis and botulinum toxin. Ann. Readapt. Med.Phys. 2003,46:338-45)，孤立器官麻痹如 HDA 的测定， (Goschel HjWohlfarth K, Frevert J，Dengler R，Bigalke H:Botulinum A toxin therapy!neutralizing and nonneutralizing antibodies-therapeutic consequences. Exp. Neurol. 1997, 147:96-102 ；HUGHES RjWHALER BC.Influence of nerve-ending activity and of drugs on the rate of paralysis of rat diaphragm preparations by Cl.botulinum type A toxin. J.Physiol. 1962, 160:221-33)，基于细胞的测定 法，如使用原代神经元的SNAP-25剪切蛋白质印迹测定（Pellett S，T印p WH，Toth SI,Johnson EA: Comparison of the primary rat spinal cord cell (RSC) assay and the mouse bioassay for botulinum neurotoxin type A potency determination. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2010, 61:304-10)以及体外试验，其中，然而，仅测定神经 毒素的生物活性的单一方面，如结合测定法或SNAP-25剪切测定法（Evans ER, Skipper PJ，Shone CC:An assay for botulinum toxin types A，B and F that requires both functional binding and catalytic activities within the neurotoxin. J. Appl. Microbiol. 2009,107:1384-91 ；Habermann E:1251-labeled neurotoxin from Clostridium botulinum A:preparation,binding to synaptosomes and ascent to the spinal cord. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1974, 281:47-56 ；Ekong TA, Feavers IM，Sesardic D:Recombinant SNAP-25is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro. Microbiology 1997, 143:3337-47)。
[0008] 小鼠LD50测定法是迄今唯一可靠的用于定量神经毒素的生物活性和用于评估它 们的治疗潜力和/或它们的毒性的测定法。在制造神经毒素时，所述测定法也被接受用于 质量控制的目的。在小鼠LD 50生物测定法中，致死和亚致死浓度的含有神经毒素多肽的 样品必须注入到至少120只动物。在72小时的观察期内杀死动物的数目允许确定样品中 的神经毒素多肽的浓度。该测定法的明显缺点是大量将被处死的动物以及在测试过程中对 于所述动物的高水平的应力和疼痛。
[0009] 已经提出的体外测定法迄今都是基于测定在无细胞体系中的SNAP25剪切或对原 代神经元神经毒素暴露。但是，这些测定法是较不可靠的和/或不考虑所有的希望的神经 毒素功能。因此，目前，上述的LD 50生物测定法是在欧洲药典中一段描述的用于BoNT/A 的唯一可靠的测定法。然而，需要一种避免现有技术中所描述的测定法的缺点，用于测量神 经毒素活性的可靠测定法。
[0010] 因此，本发明的技术问题可以看作是提供满足前述需要的手段和方法。通过在权 利要求中表征的和本文下面描述的实施方案解决了该技术问题。
[0011] 本发明涉及一种编码融合多肽的多核苷酸，所述融合多肽包括（i)转录因子结构 域和（ii)胞质滞留结构域，由包括神经毒素切割位点的接头隔开。
[0012] 如本文所使用的术语"多核苷酸"是指单链或双链DNA分子，以及RNA分子。由所 述术语涵盖的是基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及这些分子种类的所有天然存在的或人 工修饰的衍生物。所述多核苷酸在一个方面可以是线性或环状分子。另外，除了编码本发 明的融合多肽的