全身性送递口服疫苗及治疗剂的组合物和方法

专利名称：全身性送递口服疫苗及治疗剂的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用修饰型肉毒杆菌毒素向全身送递口服疫苗及治疗剂的组合物和方法，其中该毒素保留了其穿透肠壁的能力但已没有毒性。
背景技术：
梭菌神经毒素是目前已知毒性最强的蛋白质毒素。破伤风梭菌产生的神经毒素(破伤风毒素)经由开放性伤口进入人体。但至少在工业化国家，由于有安全、有效、便宜的疫苗大量提供和广泛应用，破伤风的毒性作用已不再是主要的有害公众健康的问题。这种破伤风疫苗主要是将发酵罐中破伤风梭菌培养物的上清用甲醛灭活而产生的。
由肉毒梭菌、丁酸梭菌、巴氏梭菌产生的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是肉毒中毒的主要病因(Simpson，L．药理学毒理学年鉴(Annu．Rev．Pharmacol．Toxicol．)1986 26427-453)。人们经常因食物中毒而接触这种神经毒素，由创伤引起的肉毒中毒很少见。已开发出类似于破伤风疫苗的肉毒疫苗以预防肉毒中毒的毒性作用。但由于肉毒杆菌毒素有七种不同血清型，只有分别制备出七种疫苗再联合给药才能用这样的灭活疫苗产生全面的保护作用。目前的肉毒杆菌毒素疫苗只包含七种血清型中的五种。况且，某些血清型的产生菌株人工培养时毒素产量不高。因此，由于对完全活性毒素进行操作有很大危险性，这使得疫苗用毒素的生产、纯化和灭活既费时又消耗很大(Clayton等，感染与免疫199563(7)2738-2742)。目前，只有疾病控制中心可为实验用途提供这种疫苗。
通常，肉毒中毒是由于摄取了被毒素污染的食物，或摄取了被能在肠道中产生毒素的生物体污染的食物。不管来源如何，对肉毒杆菌毒素首先合成的是相对无毒性、分子量约150kDa的单链多肽。要具备完整毒性必须进行翻译后加工，即由蛋白酶将该分子切割得到双链结构，其中的重链(约100，000道尔顿)通过二硫键与轻链(约50，000道尔顿)连接。这一双链分子是具有生物活性的全毒素。BoNT自肠道转移至全身循环(淋巴和血液)，再到达毒素作用的靶位点胆碱能神经末梢，在此作为锌依赖性内切蛋白酶对胞吐作用所必需的多肽进行切割(Montecucco，D．＆Schiavo，G．分子微生物学1994 131-8)。对这些多肽的切割导致递质释放受阻及麻痹。
一般认为毒素的重链是毒素结合并自胆碱能神经末梢外转运至内部所必需的，而轻链则有锌依赖性内切蛋白酶活性，使毒素能抑制胆碱能神经末梢(Neimann等，Behring Inst．Mitt．1991 89153-162)。因此，有关文献描述了包含肉毒梭菌无毒性的50kDa羧基端片段的抗肉毒中毒疫苗。LaPenotiere等，Toxicon 1995 33(10)1383-6和Clayton等，感染与免疫1995 63(7)2738-2742。此外，有人提出可将这种强选择性神经毒素和破伤风毒素改造成无毒性治疗工具，以便向中枢神经系统送递药物、激素、酶或抗病毒物质。
发明简述本发明目标之一是提供修饰型肉毒杆菌毒素，它保留了自肠道向全身循环转运的能力但不具毒性。这种修饰型肉毒杆菌毒素可作为针对包括肉毒杆菌毒素在内的抗原肽的口服疫苗，以及用于经口服送递其它治疗剂至全身循环。
附图简述

图1为天然肉毒杆菌毒素。此图显示在天然毒素中带有锌结合基元的轻链通过二硫键与重链连接。
图2为本发明之修饰型肉毒杆菌毒素的例图。此图显示带有修饰的锌结合基元的轻链与肉毒杆菌毒素的完整重链连接。
发明详述现代医学的主要挑战之一是口服药物的开发。激活全身免疫的口服肽疫苗的开发尤其存在很多问题。有关开发口服肽疫苗的难题包括在人的肠道中因低pH和蛋白酶裂解而致的降解；药物中引起疾病的抗原区过大，无法从肠腔显著地非特异性扩散到达全身循环；不能设计出能有效地结合肠道受体并经主动运输到达全身循环的肽疫苗。尽管有这些困难，人们还是在口服疫苗研究领域进行着很大努力。例如近来有人提出用基因工程食物如土豆或香蕉等为载体大范围免疫接种。但将抗原肽经基因工程导入随后将被摄取的食物并没克服这些困难。因此，需要能从肠道将抗原肽或其它治疗剂可靠并可重复地转运至全身循环的药物送递载体。
本发明提供修饰型肉毒杆菌毒素，它可作为口服送递载体将包括但不限于肉毒杆菌毒素在内的抗原肽和其它治疗剂送递至全身循环。现已发现肉毒杆菌毒素通过与单层细胞生长的极化肠道细胞粘膜侧上的浆膜特异性(serospecific)受体结合，而从肠道转运至全身循环。结合的毒素被主动转运穿过细胞，完好无损地转移至单层细胞培养的浆膜侧。有人提出，附属蛋白如血凝素(非共价蛋白复合物的成分，这种复合物包含有梭菌释放的肉毒杆菌毒素)可能介导毒素的结合和跨肠壁转运过程。但用重组全毒素进行的实验已证实，肉毒杆菌毒素自身就有识别肠细胞表面受体的结合区。而且还证实，可通过修饰毒素的轻链，而在不改变该蛋白由肠道转运至全身循环之能力的前提下使之不再有毒性。因此，本发明中“修饰型肉毒杆菌毒素”指保留其从肠道转运至全身循环能力而无毒性的肉毒杆菌毒素。使肉毒杆菌毒素无毒的改变包括轻链氨基酸序列的突变及轻链或其部分的缺失。在一个优选实施方案中，突变的是轻链的锌结合区或底物结合区。本发明中“无毒”指胆碱能神经末梢遇到修饰型肉毒杆菌毒素不会导致神经末梢中的递质释放受阻和麻痹。使肉毒杆菌毒素无毒性的改变对毒素从肠道转运至全身循环能力的影响可按本文的教导常规分析，因此技术人员可鉴别本发明的修饰型肉毒杆菌毒素。属于这种修饰型肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌毒素可另含有除肉毒杆菌毒素或治疗剂之外的蛋白抗原。
例如，可制备包含其中全毒素轻链的锌结合区被灭活的肉毒杆菌神经毒素的组合物。修饰型毒素无毒，因为全毒素没有保留导致神经肌肉阻断的能力，但对轻链的修饰不影响毒素分子的其余部分脱离肠腔进入全身循环的能力。在这一优选实施方案中，轻链锌结合区的至少3个氨基酸得到了修饰。尤其是天然序列中的His(第229位)、Glu(第230位)、His(第233位)分别由Gly、Thr和Asn取代，产生SEQ ID N01。编码该修饰型肉毒杆菌毒素的核酸序列示于SEQ ID NO2。这些氨基酸取代消除了全毒素与催化锌或其它二价阳离子结合的能力。
还有实验证实无切割型或单链型肉毒杆菌毒素也能结合并跨肠壁转运。因此，本发明之修饰型肉毒杆菌毒素还包括除去了切割位点的组合物。
本发明之修饰型肉毒杆菌毒素的生物活性经体内毒性试验、体外对小鼠膈神经一半膈制备物的活性、和在突触小体粗制剂中的酶活性进行测定。在这些实验中，修饰型肉毒杆菌毒素(本文称为修饰型重组体或修饰型rBoNT／C)由肉毒杆菌毒素C血清型经定点诱变灭活全毒素轻链上内切蛋白酶活性必需的锌结合区而产生。但本领域内技术人员也可应用肽合成的其它方法，包括但不限于生化技术，如酶切肽并使所得片段交联。此外，由于不同肉毒中毒(botulism)血清型结构和功能都相似，因而技术人员也可按常规方法由不同于肉毒梭菌C血清型的其它血清型制备修饰型肉毒杆菌毒素。例如，肉毒杆菌毒素的所有血清型都先合成为相对无活性前体，分子量约150，000。每一例中，前体必须经蛋白酶切割产生双链分子，其中重链(100，000 kDa)经二硫键与轻链(50，000 kDa)连接。肉毒杆菌毒素的每种血清型优先作用于胆碱能神经末梢以阻断递质释放，其中重链主要作为组织定位区指导毒素结合胆碱能神经末梢，轻链在神经末梢内部发挥作用，阻碍递质释放。作为锌依赖性金属内切蛋白酶而对递质释放所必需的多肽家族中一个或多个成员进行切割的是每种血清型的轻链。每种血清型中都有酶活性必需的锌结合区His-Glu-X-X-His(SEQ ID NO3)。对结合区的修饰总是导致酶活性的丧失。此外，将包含锌结合区的每种血清型中一部分的核酸和氨基酸序列对比，证实锌结合区附近及区内的序列具有高度一致性。所以，肉毒梭菌C血清型实例可代表整类蛋白。
修饰型rBoNT／C全毒素的体内毒性试验证实，锌结合区内有突变的修饰型肉毒杆菌毒素在给药后16周监控期内对小鼠即使在高剂量(每只小鼠腹膜内注射10μg)也没产生急性毒性作用。无一只小鼠出现明显的神经毒性或其它明显的有害影响。相反，腹膜内接受100ng天然BoNT／C的小鼠在注射2-2．5小时后死亡。
另在小鼠膈神经-半膈制备物中比较了修饰型BoNT／C全毒素与天然BoNT／C的体外毒性。结果发现，膈神经-半隔制备物中加入修饰型肉毒杆菌毒素不产生神经肌肉阻碍(1×10-10M；n=4)。对比之下，加入天然BoNT／C(1×10-12M；n=8)总是产生传导麻痹(平均值±标准误差=152±17分钟)。
这种修饰型肉毒杆菌毒素激活免疫应答的能力也在口服(p．o．)给药和皮下(s．c．)注射后检测。如免疫印迹试验测得，修饰型rBoNT／C全毒素经p．o．和s．c．给药刺激了体液中抗体的产生。因此，本发明之修饰型肉毒杆菌毒素保留了它穿过肠壁仍有活性和经主动运输转移出肠道的能力。这一点在以下发现中更进一步证实经s．c．给予该修饰型肉毒杆菌毒素的不均一制剂(其中包含少量无关蛋白)，可激活针对这些无关蛋白的免疫应答，而经p．o．给药产生的抗体只针对该修饰型肉毒杆菌毒素。
经p．o．和s．c．给予修饰型肉毒杆菌毒素所产生抗体的保护作用随后在血清中和试验和体内毒性试验中得到证实。不管用哪种给药途径，修饰型肉毒杆菌毒素免疫动物的血清都可灭活大剂量(约10，000 LD50)的天然BoNT／C。类似地，在体内毒性试验中，无论经p．o．还是s．c．途径免疫接种修饰型肉毒杆菌毒素，均明显降低了随后注射的天然毒素的效力。口服修饰型肉毒杆菌毒素的动物在其血清中有至少3个月可测到抗体。此外，无论经p．o．还是s．c．途径免疫接种修饰型肉毒杆菌毒素的动物，在第三次加强免疫的3个月后均能受到保护而免于天然BoNT／C的攻击。
因此，这些实验的结果证实，可根据本文教导构建无毒性、但保留自肠道转移至全身循环并刺激产生保护性抗体的修饰型肉毒杆菌毒素。而且，包含本发明之修饰型肉毒杆菌毒素的组合物作为口服疫苗保护动物免于肉毒中毒很显然是有效的。
此外，由于本发明之修饰型肉毒杆菌毒素保留了它们自肠道转移并完整无损地送递至全身循环的能力，这些修饰型肉毒杆菌毒素可作为送递载体将口服给予的非肉毒杆菌毒素的蛋白和治疗剂送递至全身循环。应用修饰型肉毒杆菌毒素作为口服疫苗的载体的方法很多。例如，因轻链锌结合区的灭活不会负面影响毒素从肠道转移的能力，故天然肉毒杆菌毒素的锌结合区可被所选另一种蛋白，即非肉毒杆菌毒素的蛋白的抗原替换，以产生针对这另一种蛋白的口服疫苗。或者，可应用蛋白质化学和分子生物学的已知技术使所选抗原或其部分附着至修饰型肉毒杆菌毒素上。所得修饰型肉毒杆菌毒素不仅无毒，而且保留了其自肠道转移至全身循环的能力，因此所选抗原口服后可到达全身循环而激活对抗该蛋白的全身免疫。可与修饰型肉毒杆菌毒素一起经口服给药的疫苗实例有但不限于卡介苗、霍乱、白喉、乙型肝炎、麻疹、脑膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、鼠疫、脊髓灰质炎、狂犬病、风疹、破伤风、伤寒和黄热病的疫苗。该口服疫苗可单独使用或联合应用，如DTP(白喉、破伤风、百日咳)。送递口服疫苗的能力对于医护人员不易获得的地区尤其重要。而且，本发明的口服疫苗除了不需要技术人员外，还有重要的经济优势，因为它避免了使用注射器和／或处置用过的注射器的费用。
本发明口服疫苗的配方优选包含修饰型肉毒杆菌毒素及药学可接受载体，如无茵生理盐水、含0．1％明胶的无菌盐水、或含1．0mg／ml牛血清白蛋白的无菌盐水。或者，本发明之修饰型肉毒杆菌毒素可经基因工程导入植物，使该植物产生的食物如土豆或香蕉可作为大范围预防接种的载体。通过基因工程使植物表达外源肽的方法为本领域内已知，如于1996年6月6日提交的PCT／US96／09558中的方法。
本发明之修饰型肉毒杆菌毒素还可用于构建嵌合型口服治疗剂。此实施方案中将一种治疗剂与修饰型肉毒杆菌毒素连接，产生两大类口服给予的分子(1)带有生物稳定性连接的新药，及(2)有生物或化学不稳定性连接的偶联前体药物，到达血液后即与载体分离。联合治疗技术的实例参见Lautenslager，G．T．＆ Simpson，L．L“用内源物质构建的嵌合分子”分子和细胞生物学进展，第9卷，第233-262页，JAI出版公司(1994)。例如，可以将治疗肽附着剂修饰型肉毒杆菌毒素上，由此产生的制剂有取代物的特点但仍能经口服给药。一个实例如口服溶血栓剂的生成。将P-选择蛋白与组织纤溶酶原激活物(TPA)组合而成的融合蛋白极具应用价值，它显示有溶血栓活性并可定向到血栓。这一嵌合体必须导入血流。然而，用分子生物学或蛋白质化学，都可将此“第一级”嵌合分子与本发明的修饰型肉毒杆菌毒素结合，从而产生具有新添加的可经口服转运至全身循环优点的较高级嵌合体。另一实例是口服抗肿瘤药物的设计。已公开了各种抗肿瘤药物，其中利用一分子的细胞毒特性，并与特异性定位毒素的另一分子一部分融合。一个更新的实例将假单胞菌外毒素(PE)的氨基端与表皮生长因子(EGF)融合，产生的EGF-PE嵌合体能用作有EGF受体的癌症细胞的细胞毒药物。将此嵌合体与本发明之修饰型肉毒杆菌毒素连接可产生口服用较高级嵌合体。
应用修饰型肉毒杆菌毒素作为疫苗或其它治疗剂载体的概念对人和对非人类动物都适用，只有一个例外。肉毒杆菌毒素的所有血清型在各物种中作为药物载体不可能具有同等效力。临床证据提示，人类特别对A、B和E血清型的作用敏感。这可能与这三种血清型从胃肠道系统吸收的效率有关。因此，A、B和E血清型将为人用治疗剂的优选载体。
另一方面，大多数非人类动物均对C血清型特别敏感。这提示对兽医学而言，非人类动物用治疗剂的优选载体是C血清型。可与修饰型肉毒杆菌毒素一起口服给药的动物疫苗实例有但不限于针对腺病毒2型、支气管炎博德特菌、肉毒中毒、杯状病毒、鹦鹉热衣原体、梭菌病如产气荚膜梭菌C型、冠状病毒、温热、马脑脊髓炎、大肠杆菌、猫传染性腹膜炎、猫白血病病毒、猫传染性粒细胞缺乏症、肝炎、钩端螺旋体病、副流感病毒、细小病毒、狂犬病、鼻气管炎病毒以及破伤风的疫苗。
以下实施例只为举例说明，并非限制本发明。
限制性内切酶和DNA修饰酶购自New England Biolabs(Beverly，MA)。表达载体pQE-30和镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖购自QIAGEN(Chatsworth，CA)。6xHis亲和标记的特异性单克隆抗体(mAb)购自QIAGEN。抗突触融合蛋白mAb(S-0664；抗HPC-1)购自SIGMA(St．Louis，MO)，马抗BoNT／C抗体来自疾病控制中心(CDC，Atlanta，GA)。带有BoNT／C DNA的EcoRI片段的质粒pCL8和pCH3如Kimura等BBRC 19901711304-1311所述。
实施例1构建合成rBoNT／C全毒素所用的表达载体天然肉毒杆菌毒素如图1所示。修饰型肉毒杆菌毒素rBoNT／C如图2所示。修饰型肉毒杆菌毒素rBoNT／C的核酸和蛋白序列分别示于SEQ IDNO2和SEQ ID NO1。
分离DNA片段、用DNA聚合酶I的Klenow片段修复突出端、用T4连接酶进行连接的技术已为本领域内熟知并已有描述，如Sambrook等，1989分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY。所有克隆步骤及表达均在带有pREP4阻遏蛋白质粒的大肠杆菌M-15菌株(QIAGEN)中完成。
编码修饰型肉毒杆菌毒素重组体的基因是从PCR产生的三个不同毒素片段(片段I、II和III)装配而成并连接至载体pQE-30得到质粒pQE-TCl。首先，由质粒pCL8经两个连续步骤扩增BoNT／C氨基端部分(片段I和II)的编码DNA，产生pBot C2。DNA片段I(第4-689位核苷酸)用以下寡核苷酸引物对扩增(正向)5′-CCCAATAACAATTAACAACTTTAAT-3′(SEQ ID NO4)KpnI(反向)5 ′-TTTGGTACCCATTAAAATTAGTATTGGATCCAT-3′(SEQ ID NO5)有一个胞嘧啶加在正向引物的5’端以便于重新构建BamHI限制性位点，以及将rBoNT／C DNA与pQE-30翻译甲硫氨酸的起始区的阅读框架一致地进行克隆。反向引物中包含KpnI限制性位点，以便在片段I的3’端产生氨基酸突变His229→Gly和G1u230→Thr。扩增的片段I经T4聚合酶处理，KpnI切割并插入表达载体pQE-30中Klenow补平的BamHI和KpnI位点之间，得到质粒pBot Cl。 DNA片段II(第689-1633位核苷酸)用寡核苷酸引物扩增KpnI(正向)5′-TTTGGTACCCTTAATAATGCAATGCATAATTTATATGGA-3′(SEQ ID NO6)EcoRI(反向)5 ′-GAATTCAAATAATCAACATTTTGAG-3′(SEQ ID NO7)正向引物中导入了核苷酸的改变，以产生KpnI位点并在片段II的5，端产生氨基酸突变His229→Gly、Glu230→Thr和His233→Asn。反向引物与BoNT／C序列互补并在第1633位核苷酸处包含一个内部EcoRI位点。扩增的片段II经T4聚合酶处理、KpnI切割、插入pBot Cl的KpnI和Klenow补平的SalI位点之间。所得质粒pBot C2含有与pQE30的ATG密码子和6xHis亲和序列读框一致的BoNT／C 5’端片段(第4-1633位核苷酸)。
BoNT／C的羧基端结构域编码DNA片段III(第1633-3873位核苷酸)由质粒pCH3用以下寡核苷酸引物扩增而得EcoRI正向5′-TTTGAATTCTTATTATTACCTAGAATC-3′(SEQ ID NO8)SacI反向5′-TTTGAGCTCTTATTCACTTACAGGTACAAAAC-3′(SEQ ID NO9)正向引物与BoNT／C序列互补并在第1632位核苷酸处包含一个内部EcoRI位点。反向引物中紧邻终止密码子下游导入了一个SacI限制性位点。扩增的片段III经EcoRI和SacI消化，分别克隆至EcoRI和SacI消化的质粒pQE-30中，产生质粒pBot C3。最后重新构建编码全长的修饰型肉毒杆菌毒素的DNA，方式是将质粒pBot C2的EcoRI-EcoRI片段(第-88至+1632位核苷酸)导入EcoRI消化的、小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化的质粒pBot C3，得到质粒pQE-TCl。所有PCR片段再次经DNA测序分析。
设计寡核苷酸引物以便在编码锌结合区的DNA片段中引入KpnI限制性位点。在该DNA片段中引入KpnI限制性位点可使锌结合必需的三个氨基酸发生突变(His229→Gly、G1u230→Thr和His233→Asn)，而且无需先克隆野生型BoNT／C DNA便可重新构建编码修饰型肉毒杆菌毒素的DNA。由质粒pQE-TCl合成的修饰型肉毒杆菌毒素重组体在氨基端包含11个额外的氨基酸Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser(SEQID N010)。
实施例2 神经毒素表达的优化利用PCR修饰pQE-30载体中编码修饰型rBoNT／C的结构基因前面的序列。利用在5’端包含10个额外的核苷酸的新正向引物5’-CGGTACCATGCCAATAACAATTAACAACTTT-3’(SEQ ID NO11)和覆盖BoNT／C序列第892位BglII限制性位点的新反向引物BglII5＇-AGCTATAGATCTATAATAATCCAA-3′(SEQ ID NO12)(Kimura等，生物化学及生物物理研究通讯1990 1711304-1311)重新扩增编码rBoNT／C氨基端部分的DNA片段。所扩增的片段经T4聚合酶处理、BglII切割并插入pQE-TCl的Klenow补平的BamHI和BglII位点之间，得到质粒pQE-TC2。
实施例3 修饰型rBoNT／C全毒素的表达和纯化在Lennox L肉汤培养基上37℃振荡培养至A600达到0．6-0．8。加入异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷至终浓度为1．0mM，继续培养5小时。经4℃离心从1升已诱导的培养物中收获细菌，重新悬浮于含300mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7．4)20ml中。在冰浴上用60型超声破膜仪(Fisher Scientific，Malvern，PA)以每分钟2个75％动力的脉冲超声裂解细胞。裂解物在4℃以20，000xg离心30分钟。将澄清的上清液与1ml包装了Ni-NTA的树脂混合，于4℃摇床温育1小时，最终倾于25ml柱中。用30体积的洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，pH6．0，300mM NaCl，25mM咪唑)洗涤柱。结合的蛋白质用洗脱缓冲液(50mM磷酸钠，pH4．5，300mM NaCl)洗脱。纯化蛋白在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行分析。
实施例4 免疫印迹分析大肠杆菌驱动质粒pQE-TCl上的修饰型肉毒杆菌毒素重组体表达的能力通过对细胞提取物的免疫印迹分析进行检测。用于蛋白印迹分析的蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶上按Laemmli，U．K．自然1970 22680-685的方法分离，转移至硝酸纤维素膜上，检测带有6xHis亲和标记的免疫反应性蛋白。加入1∶2000稀释的抗6xHis亲和标记mAb或抗BoNT-C抗体于37℃温育1小时以完成与第一抗体的共同温育。用增强的化学发光法按说明书(ECL；Amersham公司，Arlington Heights，IL)进行膜显色。重组体蛋白的合成用IPTG诱导，分为等份的溶解细胞进行SDS-PAGE。
用抗6xHis标记或抗BoNT／C抗体进行蛋白印迹分析显示出极低水平的表达。因此，构建了一个新质粒pQE-TC2，它不含因将神经毒素DNA克隆至pQE-30载体的BamHI位点而带的四个胞嘧啶核苷酸。抗6xHis标记抗体的蛋白印迹分析显示pQE-TC2能较有效地驱动修饰型rBoNT／C全毒素的合成。事实上，1L Lennox肉汤培养物中可纯化得到1-2mg修饰型rBoNT／C全毒素。
修饰型rBoNT／C全毒素被合成为可溶形式，无可见的降解，但不同于肉毒梭菌的是大肠杆菌不能使修饰型rBoNT／C全毒素有效切割。经考马斯亮兰染色或蛋白印迹只能在修饰型rBoNT／C全毒素中检测到极微量的L链。但用固相TPCK-胰蛋白酶(Pierce，Roekford，IL)可使修饰型rBoNT／C全毒素有效切割，产生正确分子量的重链和轻链。由pQE-TC2合成的修饰型rBoNT／C全毒素在氨基端包含14个额外氨基酸(Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser-Gly-Thr(SEQID NO13))。此14氨基酸区段中的6xHis序列可用于合成蛋白的纯化及随后检测。以此方式产生的重组体蛋白在Ni-NTA树脂上用6xHis亲和标记进行亲和层析纯化。特异性结合的蛋白质用低pH洗脱缓冲液(pH4．5)洗脱并在SDS-PAGE上进行分析。对从亲和树脂上洗脱的蛋白的分析显示，毒素可纯化至80-90％的纯度。纯化的修饰型重组体BoNT／C或修饰型rBoNT／C可用于本文提到的所有研究。
实施例5 重组体蛋白的生物分析如以下实施例所述，用体内毒性检验、体外对小鼠膈神经-半膈制备物的活性以及在突触小体粗制品中的酶活性来分析纯化重组体蛋白的生物活性。
A．体内毒性检验对修饰型rBoNT／C全毒素的毒性进行了检验。从组氨酸亲和树脂上洗脱纯化的修饰型rBoNT／C全毒素用含1mg／ml BSA的PBS稀释，对小鼠进行腹膜内注射(i．p．)。rBoNT／C全毒素按平均体重为25g的每只小鼠以10μg的浓度于PBS-BSA 100μl等分液中给药。对小鼠进行为期16周的监控，以排除非特异性毒性。
B．体外毒性检验在小鼠膈神经-半膈制备物中用Simpson等J．Pharmacol．Exp．THer．1990 25498-103的方法分析毒性。切取组织，悬浮于通有95％O2、5％CO2的生理缓冲液中，维持在35℃。生理溶液组成如下(毫摩尔)NaCl，137；KCl，5；CaCl2，1．8；MgSO4，1．0；NaHCO3，24；NaH2PO4，1．0；D-葡萄糖，11；明胶，0．01％。膈神经连续接受刺激(1．0Hz；持续0．1-0．3毫秒)，记录肌肉颤搐。毒素诱导的麻痹以针对神经刺激的肌肉颤搐应答的50％减少计算。
C．底物的切割突触小体(1mg／ml)按Rosahl等，细胞1993 75661-670的方法制备。在有修饰型rBoNT／C全毒素(100nM)存在的情况下将突触小体于37℃在Tris缓冲盐水(TBS)或含10mM二硫苏糖醇的TBS中温育90分钟。在平行实验中，在有或无天然BoNT／C的情况下温育突触小体膜。蛋白质在15％SDS-PAGE上分离，转移至硝酸纤维素膜上，用抗突触融合蛋白mAb检测免疫反应性蛋白。
实施例6 用修饰型rBoNT／C全毒素免疫的小鼠的血清抗体应答体重约25克的Swiss-Webster雌性小鼠(Ace Animals，Boyertown，PA)在平行实验中经s．c．或p．o．分别免疫接种rBoNT／C全毒素或TBS，以评估这种肽激发血清免疫应答的能力。
A．免疫接种和样品收集s．c．注射组每只小鼠接受溶于0．1ml洗脱缓冲液中的2μg蛋白。口服组每只小鼠经胃内喂食针喂食溶于0．2ml洗脱缓冲液中的4μg蛋白。小鼠在第0天免疫，并在第14、28和42天加强免疫。在免疫接种后的第21、35和49天采集相同免疫方式小鼠的血清样品并将血清集中。采集血清时，小鼠在异氟醚麻醉下用加有肝素的毛细管在眼眶后血管丛中放血。
B．分析血清中的抗体生成用免疫印迹试验分析免疫小鼠或对照小鼠的血清对未切割的修饰型肉毒杆菌毒素的免疫反应性，检测抗体。重组体抗原(修饰型肉毒杆菌毒素；0．1μg／泳道)经SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜上。膜用5％无脂奶粉的TBS封闭，剪成小条，用各种血清样品检测免疫反应性蛋白。第一次温育用1∶1000稀释的血清于室温过夜(18小时)。辣根过氧化酶标记的抗小鼠IgG第二抗体以1∶10，000稀释度室温温育1小时。充分洗涤后，用ECL(Amersham)使膜显色。
实施例7 免疫小鼠血清的中和活性用实验评估各种血清样品中和天然BoNT／C的能力。检验了三种不同来源的血清，如下1)未免疫血清，2)经p．o．接受修饰型rBoNT／C全毒素免疫的动物的血清，和3)经s．c．接受修饰型rBoNT／C全毒素免疫的动物的血清。天然BoNT／C(10μl，100ng)与免疫前或免疫血清10μl，或与PBS-BSA于37℃温育1小时。然后用含有1mg／ml BSA的PBS 80μl稀释温育混合液，腹膜内注射。对小鼠实行48小时监控以评估各种混合物的残留毒性。
实施例8 保护小鼠抵抗天然BoNT／C的攻击第三次加强免疫的三个月后，rBoNT／C免疫小鼠经腹膜内途径按每只小鼠100ng天然BoNT／C的剂量接受攻击。对受攻击小鼠的存活情况监控5天。
本文引用的各专利、专利申请和出版物均全文引入本文作为参考。
本发明参照具体实施方案进行了公开，本领域内其他技术人员可在不背离本发明之精神和超出本发明之范围的前提下设计其它实施方案并作其它修改。所附权利要求书意在包括所有这类实施方案和等价变异形式。
序列表<110>SIMPSON，LANCEKIYATKIN，NIKITAMAKSYMOWYCH，ANDREW<120>全身性送递口服疫苗和治疗剂的组合物和方法<130>JEFF-0256<140><141><150>08／954，302<151>1997-10-20<160>13<170>PatentIn Ver．2．0<210>1<211>1291<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述修饰型肉毒杆菌毒素<400>1Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Ser Asp Pro Val Asp Asn1 5 10 15Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Asp Thr His Leu Asn Thr Leu Ala Asn Glu20 25 30Pro Glu Lys Ala Phe Arg Ile Thr Gly Asn Ile Trp Val Iie Pro Asp35 40 45Arg Phe Ser Arg Asn Ser Asn Pro Asn Leu Asn Lys Pro Pro Arg Val50 55 60Thr Ser Pro Lys Ser Gly Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Ser Thr Asp65 70 75 80Ser Asp Lys Asp Thr Phe Leu Lys Glu Ile Ile Lys Leu Phe Lys Arg85 90 95Ile Asn Ser Arg Glu Ile Gly Glu Glu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Thr100 105 110Asp Ile Pro Phe Pro Gly Asn Asn Asn Thr Pro Ile Asn Thr Phe Asp115 120 125Phe Asp Val Asp Phe Asn Ser Val Asp Val Lys Thr Arg Gln Gly Asn130 135 140Asn Trp Val Lys Thr Gly Ser Ile Asn Pro Ser Val Ile Ile Thr Gly145 150 155 160Pro Arg Glu Asn Ile Ile Asp Pro Glu Thr Ser 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His His His His His His Gly Ser Gly Thr1 5 10
权利要求
1．一种修饰型肉毒杆菌毒素，其中包含能从肠道转运至全身循环并已变为无毒性的肉毒杆菌毒素。
2．权利要求1的修饰型肉毒杆菌毒素，其中还包含一种选择的抗原。
3．权利要求1的修饰型肉毒杆菌毒素，其中还包含一种治疗剂。
4．一种抗肉毒中毒的口服疫苗，其中包括权利要求1的修饰型肉毒杆菌毒素以及药学可接受的载体。
5．抗所选抗原的口服疫苗，其中包含权利要求2的修饰型肉毒杆菌毒素以及药学可接受的载体。
6．向动物口服送递治疗剂的方法，包括给予该动物权利要求3的修饰型肉毒杆菌毒素。
全文摘要
用所提供的能从肠道转运至全身循环、但已变为没有毒性的修复型肉毒杆菌毒素口服送递抗原或治疗剂至全身循环的组合物和方法。
文档编号A61P31/04GK1290174SQ98811298
公开日2001年4月4日 申请日期1998年10月16日 优先权日1997年10月20日
发明者L·辛普森, N·基亚特肯, A·马克思莫威克 申请人:托马斯杰斐逊大学