专利名称：丙撑亚胺衍生物和以此为有效成份的促进双尾菌分裂组合物及其制法的制作方法
技术领域：
本发明是关于新型丙撑亚胺衍生物、以此为有效成份的促进双尾菌分裂组合物及其制造方法。
双尾菌是动物粪便中的常在菌，每1克健康活体的粪便中就有100亿个以上，它产生对促进肠上皮细胞吸收营养成份、水份、电解质有效的各种短链脂肪酸。另外，众所周知，它还能提高肠道免疫机能。具有这样有用性质的双尾菌，因动物体内各种各样的环境变化、外界因素、老化等原因而急剧减少。其结果是引起肠道异常，双尾菌在原来寄生的动物体里减少或者增殖活性下降了。这样，激活双尾菌的问题就很重要了。微生物的增殖虽然是原来的一个细胞反复分裂增加着，但作为其指标，是以加倍速度(doubling time)作为参考。所谓加倍速度就是从一代细胞分裂到下一代细胞分裂的所需要的时间。平均说来，各种微生物的加倍速度为大肠杆菌是17分钟、乳酸菌是20分钟、杆菌(Bacillus)属菌是30分钟、酵母是120分钟等。过去作为能促进分裂的物质喹诺酮等化合物的辅酶虽然有名，但不容易将微生物本身具有的增殖能力加速到一定程度。各种微生物都有离开最适环境的时候，例如，把厌气性双尾菌在好气条件下长时间放置，将丧失生育活性。即使在动物的肠内，由于疾病、环境变化、老化等原因，肠内物质中的双尾菌有时下降，即使能维持正常的菌数，肠道也有异常的情况。出现这种情况时，可以预料双尾菌的增殖活性在下降。在这种情况下，有效的手段是供给能加速双尾菌加倍速度的因子。
迄今为止，关于促进双尾菌增殖因子的报告很多，特别是以寡糖为主的十几类糖苷早就上市了。虽然这些促进双尾菌增殖物质作为选择的营养物质的特色很强，但不一定能充分激活增殖活性下降的双尾菌。
另外，即使服用以往叫做双尾菌因子的因子，尚有由于双尾菌增殖的各种作用缓和，到出现所期望的效果需要一定的时间等缺点。
根据以上观点，本发明期望可以安定地供给肠内、有显著加速双尾菌分裂的作用，并且能促进各个人原有双尾菌的增殖，效果快。
本发明目的是提供能够促进双尾菌分裂增殖的化合物、促进双尾菌分裂组合物及其制造方法。
本发明者们发现对在马铃薯杆菌(Bacillus mesentericus)的代谢产物中对各种双尾菌[长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短杆菌(B.breve)、婴幼儿易感染的细菌(B.infantis)、青少年易感染的细菌(B.adolescentis)]有促进增殖分裂作用的、推断分子量为800～900的物质(日本专利公开第344882/1993号)。本发明者们在培养马铃薯杆菌(Bacillus mesentericus)的上清液中，发现分子量为90的新型物质--丙撑亚胺衍生物有促进双尾菌分裂作用，并确立了工业生产方法，完善了本发明。
即，本发明涉及化学式(I)
表示的由3，3-二羟基丙撑亚胺或其盐构成的丙撑亚胺衍生物；以上述化学式(I)表示的丙撑亚胺衍生物为有效成份的促进双尾菌分裂组合物；以及上述丙撑亚胺衍生物的制造方法，该方法是培养使上述化学式(I)表示的丙撑亚胺衍生物产生的微生物、在培养液中产生上述丙撑亚胺衍生物，并加以提取。
本发明的新型丙撑亚胺衍生物是化学式(I)
表示的由3，3-二羟基丙撑亚胺或其盐构成的物质。
作为盐，可举出诸如盐酸盐、醋酸盐、钠盐、钙盐等加成盐。
通过微生物发酵生产本发明物质是有效的。能生产本发明物质的菌株，可举出杆菌(Bacillus)属菌，如马铃薯杆菌(Bacillusmesentericus)、枯草杆菌(B.subtilis)、纳豆杆菌(B.natto)，但是马铃薯杆菌TO-A(Bacillus mesentericus TO-A)(工技生工寄FERM P-8934)是最适合的菌株。
本发明物质的制造方法大致如下。即，为了使菌株增殖好气性菌，将上述菌株在易被利用的营养成份制备的培养基做好气培养。最好的培养基成份是由牛肉提取物、蛋白胨、蔗糖制成的。
培养方法虽然可以用好气性培养，但通气搅拌培养更好。培养温度最好为30℃～37℃，培养基的pH为中性。培养时间为12个小时就足够了，再长时间的培养不影响本发明物质的产生量。培养结束后，把培养上清液和菌丝体分离，分离精制培养上清液。
分离精制方法，先用离心分离法分离培养上清液，过滤。而后吸附在DEAE-琼脂糖CL-6B柱上，以缓冲液淋洗，通过紫外线吸收光谱的吸收峰得到三个部分。在将促进双尾菌分裂活性(以下简称为“活性”)最强的部分浓缩后，通过葡萄糖凝胶G-25超细粉(Sephadex G-25 Superfine)进一步得到四个组份。把其中活性最强的组份作为活性组份做以后的试验材料，将该材料用乙醇提取、浓缩干燥后，得到白色针状结晶，这就是本发明的物质。
本发明物质因为是从原生菌制剂[乳酸菌原末(Biothree)商品名，东亚药品工业株式会社制]里含有的菌株得来的，所以安全性没有问题。由于特别促进双尾菌分裂，所以通过改善肠内细菌群，而可应用于以改善肠道异常为目的医药品、食品、健康食品、功能食品或是特定保健用食品等。还有，工业上生产双尾菌时，作为要活化因长期保存且生育活性下降的菌种增殖刺激剂，或是作为大量培养时双尾菌的营养辅助剂也是有效的。
本发明的物质，应考虑在100℃下加热30分钟耐受性试验时制品形态的种种问题。即作为老人食品当然是粉末、颗粒、片剂，也可以利用有效的液体剂型。还有，也可以添加到需加热工序的丸剂里。
本发明物质，原有双尾菌因子的性状不同、有促进双尾菌分裂增殖特征等，并可激活增殖活性下降的双尾菌。事实上，在研究的双尾菌增殖活性的测定方法方面，发明者们把增殖活性降低的双尾菌暴露在空气里培养时，通过添加本发明的物质，能证实前述的增殖活性。所谓促进双尾菌分裂作用是本发明的最大特征。
以下根据附图，说明本发明的实施例。
图1表示BM-S对长双歧杆菌M101-2(Bifidobacteriumlongum M101-2)的增殖速度影响的测试曲线，其中
表示对照区，
表示BM-S添加区。
实施例1菌株用马铃薯杆菌TO-A(Bacillus mesentericus TO-A，以下简称为“BM”)[微工研菌寄第8394号(FERM P-8934)]。把BM接种到10ml经在高压灭菌器里，以121℃灭菌1.5分钟后的普通液体培养基中，在37℃下振荡培养12小时，得到液体菌种。随后将液体菌种接种到500ml经过在高压灭菌器里以121℃灭菌15分钟、冷却后的BM培养基[牛肉提取物1％、蛋白胨1％、蔗糖1％、氯化钠0.5％(pH7.0)]里，在37℃下深层培养24小时。培养结束后，经离心分离机(5000rpm，10分钟)分成菌丝体和上清液。上清液通过0.22μm的膜过滤器过滤除菌，得到约100ml的粗提取液(以下称为“BM-S”)通过上述得到的BM-S通过DEAE-琼脂糖CL-6B柱(柱长3cm、柱径20cm，法路马西亚制)经离子交换色层分析。以0.02MTris-HCl(pH7.2)洗净后，依次以0.1M、0.2M、0.3M、以及0.4MNaCl-0.02m Tris-HCl作为洗脱液各100ml淋洗，由280nm的紫外吸收光谱得到三个吸收峰。将得到的组份通过后面叙述促进双尾菌分裂作用测定法，进行生物测定过程中，能确认FII组份(以下简称为FII)活性。
接着，把50mlFII通过真空干燥，浓缩至十分之一，取其1ml填充至葡萄糖凝胶G-25超细粉胶体过滤柱(柱长70cm、柱径1.6cm，法路马西亚制)。将0.02M Tris-HCl(pH7.2)作为淋洗剂，流速30ml/小时，按每个试管收集5ml，测定它们的紫外吸收后可得到四个峰，得到活性最强的G-4。
将这样的G-4浓缩，得到16mg结晶。利用Bond Elut C18软片(cartridge)把它进一步脱盐得到精制物。经过分析后，具有以下的理化性质。
①分子式C3H8O2NCl②分子量125.5(M+m/z 90.0618，C3H8O2N+)③熔点145-147℃④红外线吸收光谱羟基3250cm-1及1040cm-1、铵基3000～2000cm-1及1640cm-1。
⑤500MHz1H核磁共振谱(溶剂CD3OH、内标物(CH3)4Si)δ3.669(s)3.308(ddd，J＝1.7Hz)⑥125MHz13C核磁共振谱(溶剂CD3OH、内标物(CH3)4Si)δ61.06(亚甲基)，62.80(4价碳)⑦溶解性甲醇溶解氯仿难溶吡啶难溶水易溶⑧性状及外观无色片状结晶根据以上分析结果，得到的精制物的化学式(I’)是
以(I’)表示的化学式鉴定为盐酸3，3-二羟基丙撑亚胺。实施例2关于促进双尾菌分裂作用的确认方法的说明。在121℃、15分钟高压灭菌器灭菌的10ml PY液体培养基(胰酶解酪蛋白1％，酵母粉(Difco)0.5％，盐类溶液4％，L-半胱氨酸0.05％(pH7.2))里接种长双歧杆菌M101-2(Bifidobacterium longum M101-2)菌种，气相用CO2气体置换后，在37℃下培养24小时，得到长双歧杆菌(B.longum)培养液。PY培养基组成份别注入无菌的带螺口L型试管里，在添加了实施例1得到的BM-S0.1％的培养基里接种培养液，这时长双歧杆菌(B.longum)就变为1×104CFU。接种后，气相用CO2气体置换，密封后在37℃生物光记录器-TN-2612(高新技术)内培养。培养过程中，每隔10分钟在660nm波长测定吸光度，记住这样的条件，作双尾菌的增殖曲线。作为对照，代替BM-S培养基把新鲜的BM培养基混合后实施实验。
按这样得到培养曲线，如图1所示，与对照组比较，可见诱导期可大大缩短，并提高对数增殖期的比增殖速度。
在本发明物质上，用同样的确认方法测定时，用适当的稀释浓度可更强烈显示出促进双尾菌分裂作用。即，最强的促进双尾菌分裂作用确认为4×10-2μg/ml。表1中表示其结果。
表1本发明物质的最适浓度供试菌株 本发明物质的浓度(μg/ml)04×10 4×10-24×10-54×10-84×10-10长双歧杆菌M101-2(Bifidobacterium0.515* 1.074 1.268 1.2571.153 1.035longum M101-2)*培养开始后经26小时后的浊度(O.D.＝600nm)实施例3以下为本发明物质对肠内各细菌的影响。通过实施例2所示的方法，研讨了对于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、青少年易感染的细菌(B.adolescentis)、婴幼儿易感染的细菌(Binfantis)、嗜热杆菌(B.thermophilum)、双乳杆菌(B.bifidum)、假长杆菌(B.pseudolongum)、枯草杆菌(B.subtile)、短杆菌(B.breve)、猪疫杆菌(B.suis)、球形杆菌(B.globosum)、假链形杆菌(B.pseudocatenulatum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、鼠伤寒沙门氏菌(Salomonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aerginosa)、催产克雷白氏杆菌(Klebsiella oxytoca)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)的影响。
结果表明，对于各种双尾菌以及乳酸杆菌(Lactobacillus)有促进分裂作用，但对于大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aerginosa)起抑制作用，而对于其它细菌没有作用。其结果列于表2、表3中。
表2本发明物质对各种双歧杆菌(Bifidobacterium)的影响本发明物质(μg/ml)供试菌株04×10-2长双歧杆菌M101-2 0.515*1.268(Bifidobacterium longum M101-2)青少年易感染的细菌A234-4 0.5181.002(B.adolescentis A234-4)婴幼儿易感染的细菌1-10-5 0.5000.652(B.infantis 1-10-5)嗜热杆菌IV-29 0.5200.581(B.thermophilum IV-29)双乳杆菌A234-40.4070.578(B bifidum A234-4)假长杆菌IV-70 0.0730.730(B.pseudolongum IV-70)枯草杆菌IV-1100.5020.635(B.subtile IV-110)短杆菌1-53-8 0.4710.466(B.breve 1-53-8)猪疫杆菌ATOO27533 0.7051.275(B suis ATOO27533)球形杆菌IV-91 0.3080.451(B globosum IV-91)假链形杆菌BB-110 0.5331.010(B.pseudocatenulatum BB-110)*O.D.＝600nm
表3本发明物质对肠内各种细菌的影响本发明物质(μg/ml)供试菌株0 4×10-2干酪乳杆菌NRIC 1042 0.420*0.420(Lactobacillus casei NRIC 1042)嗜酸乳杆菌NRIC1030 0.403 0.542(Lactobacillus acidophilus NRIC1030)鼠伤寒沙门氏菌TAg8 0.190 0.190(salomonella typhimurium TA98)大肠杆菌EF720.408 0.250(Escherichia coli EF72)绿脓杆菌PAO 0.390 0.290(Pseudomonas aerginosa PAO)催产克雷白氏杆菌GIFU31620.435 0.388(Klebsiella oxytoca GIFU3162)普通变形杆菌IID824 0.330 0.340(Proteus vulgaris IID824)*O.D.＝600nm实施例4对于各种杆菌(Bacillus)属菌的促进双歧杆菌(Bifidobacterium)增殖的效果进行了研究。按照列于实施例1里供试验用的各种杆菌(Bacillus)属菌中的马铃薯杆菌TO-A(Bacillus mesentericus TO-A)粗提取液制备方法，制成各种培养口服液，做生物测定。相对于14小时后的对照组的促进各杆菌(Bacillus)培养口服液的双歧杆菌(Bifidobacterium)增殖作用，以产生本发明物质的马铃薯杆菌TO-A(B.mesentericus TO-A)显示出最高值。其结果列于表4。
表4促进各种杆菌(Bacillus)属菌的培养口服液的双歧杆菌(Bifidobacterium)增殖效果供试菌株 O.D(＝600nm) 与对照组的比例对照组 0.515*-马铃薯杆菌TO-A 1.144 2.22(B.mesentericus TO-A)枯草杆菌(纳豆)A1.011.96[B.subtilis(natto)A]枯草杆菌(纳豆)B0.736 1.43[B.subtilis(natto)B]枯草杆菌IAM11680.881 1.71(B.subtilis IAM 1168)枯草杆菌IFO 3009 1.035 2.01(B.subtilis IFO 3009)枯草杆菌IFO 3034 1.067 2.07(B.subtilis IFO 3034)枯草杆菌IFO 13179 1.031 2.00(B.subtilis IFO 13179)*O.D.＝600nm实施例5将HM果胶10g，动物胶1g，蔗糖10g以及本发明物质0.001g混合后，充分搅拌。把混合物装进圆形胶囊(直径40mm)里，冷却后制成胶状食品500粒。实施例6将乳酸菌粉50g，酪酸菌粉20g，糖化菌粉20g，PSL(马铃薯淀粉和乳糖的混合制粒品)910g以及本发明物质0.001g混合均匀。然后用制片机制成4000片，每片200mg。
由于本发明物质具有促进双尾菌分裂作用，所以作为在活体外的双尾菌增殖因子(双尾菌增殖刺激剂或双尾菌激活剂等)，能够活化对人或动物经口服后原本寄生在肠内的双尾菌。
因此，可以改善肠内细菌群的环境，并能够改善下痢和便秘等肠道不适。
权利要求
1.丙撑亚胺衍生物，其特征在于，它是化学式(I)
表示的由3，3-二羟基丙撑亚胺或其盐构成的。
2.如权利要求1所述的丙撑亚胺衍生物，其特征在于，它是盐酸3，3-二羟基丙撑亚胺。
3.促进双尾菌分裂组合物，其特征在于，它是以化学式(I)
表示的由3，3-二羟基丙撑亚胺或其盐构成的丙撑亚胺衍生物为有效成份的。
4.如权利要求3所述的促进双尾菌分裂组合物，其特征在于，它是以促进双尾菌增殖为目的的食品。
5.如权利要求3所述的促进双尾菌分裂组合物，其特征在于，它是以促进双尾菌增殖为目的的医药品。
6.如权利要求3所述的促进双尾菌分裂组合物，其特征在于，它是以促进双尾菌增殖为目的的动物用医药品。
7.如权利要求3所述的促进双尾菌分裂组合物，其特征在于，它是以促进双尾菌增殖为目的的动物用饲料添加物。
8.一种制造权利要求1或2所述的丙撑亚胺衍生物的方法，其特征在于，培养使化学式(I)
表示的由3，3-二羟基丙撑亚胺或其盐构成的丙撑亚胺衍生物产生的微生物，在培养液中产生上述丙撑亚胺衍生物，并加以提取。
9.如权利要求8所述的制造方法，其特征在于，使用杆菌属作为丙撑亚胺衍生物的生产菌。
全文摘要
本发明提供一种新型丙撑亚胺衍生物、以此为有效成份的促进双尾菌分裂组合物及其制造方法。所述丙撑亚胺衍生物是化学式(Ⅰ)表示的由3,3－二羟基丙撑亚胺或其盐构成的。
文档编号C07D205/04GK1229076SQ9810269
公开日1999年9月22日 申请日期1998年6月30日 优先权日1998年3月18日
发明者增田隆 申请人:东亚药品工业株式会社