编码纤溶酶原激活蛋白的dna的制作方法

专利名称：编码纤溶酶原激活蛋白的dna的制作方法
技术领域：
本发明是属于动物健康领域，且涉及疫苗组合物及用于疾病的诊断。更具体地说，本发明涉及抗哺乳动物乳腺炎的疫苗，和具有编码在制备所述疫苗中有用的纤溶酶原激活蛋白核苷酸序列的多核苷酸分子。
牛乳腺炎造成奶牛奶产量的严重损失，导致对牛奶业严重的经济影响。乳腺炎可由一种或更多种细菌病原体所致。估计链球菌属的感染约占所有牛乳腺炎临床案例的30％。特别是，估计由乳房链球菌的感染约占牛乳腺炎所有病例的20％。
用于预防和治疗动物乳腺炎的传统方法包括使用卫生的挤奶技术和施用化学抗生素。然而，抗生素的使用被这样的事实所限制，即含有抗生素残留物的牛奶常被认为对于人类消费是不安全的并且必须抛弃。治疗或预防动物乳腺炎的具体方法包括Stolle等的美国专利5,198,214，其中描述了多价抗乳腺疫苗的使用，该疫苗包括从感染动物乳汁中培养的失活的致乳腺炎病原体。此外，Sordillo等的美国专利5,234,684描述了一种治疗或预防母牛乳腺炎的方法，包括向牛施用牛干扰素γ。
链球菌属种类感染泌乳乳腺的能力依赖于该细菌在分泌物中的生长能力和避免由牛噬中性细胞吞噬的能力(Leigh等.,1990，兽医学研究49:85-87)。牛奶中大多数氮以蛋白形式存在(Aston，1975，澳大利亚牛奶技术杂志(Austral.J.Dairy Tech).30:55-59)且，当缺乏蛋白水解时，链球菌在牛奶中的生长由于缺乏自由氨基酸而受限制。这由于乳酸链球菌(lacticstreptococci)对用于在牛奶中生长的细胞外酪蛋白水解蛋白酶的依赖而更显重要(Mills和Thomes,1981，N.Zeal牛奶科技杂志15:43-55)。此外，将奶蛋白裂解成氨基酸的酪蛋白水解酶，纤溶酶的存在增强了细菌在牛奶中生长的能力。
牛奶中含有纤溶酶原，其一般无蛋白水解活性，但通过纤溶酶原激活物的作用可转变为有蛋白水解活性的纤溶酶。已证实链球菌属的致乳腺炎菌株，如乳房链球菌产生能将牛纤溶酶原转变为纤溶酶的纤溶酶原激活物。该纤溶酶原激活物的活性导致奶蛋白的裂解而释放自由氨基酸，这反过来又支持了细菌在乳腺中的生长。基于该观察结果，提出诱导基于免疫的反应，如产生抗链球菌纤溶酶原激活物中和抗体的产生可用于保护动物免患乳腺炎。国际专利公开WO 93/14209，(在此引用仅供参考)证实了从乳房链球菌培养过滤物中对纤溶酶原激活物(这里命名为“链激酶”)的纯化，且进一步教导了基于这种来自链球菌纤溶酶原激活物的抗乳腺炎疫苗组合物。
具有编码纤溶酶原激活物如来自链球菌的纤溶酶原激活物核苷酸序列的多核苷酸分子的分离将大大地促进抗乳腺炎疫苗的制备。
本发明提供了一种分离的包括编码具有生物活性纤溶酶原激活蛋白(这里命名为“PauA蛋白”，以前命名为“PA”或“链激酶”)核苷酸序列的多核苷酸分子。在优选的实施方案中，PauA蛋白是来自导致或有利于哺乳动物乳腺炎的细菌如链球菌。在更为优选的实施方案中，链球菌的种类为乳房链球菌或停乳链球菌(S.dysgalactiae)。
在优选的实施方案中，本发明分离的多核苷酸分子包括这样的核苷酸序列，其编码具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中约氨基酸位置26(ILe)至约氨基酸位置286(Pro)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在非限制性实施方案中，这种多核苷酸分子分别包括从SEQ ID NO:1中约核苷酸位置195至约核苷酸位置977的多核苷酸分子或SEQ ID NO:3中从约核苷酸位置196至约核苷酸位置978的多核苷酸分子。
在更为优选的实施方案中，本发明分离的多核苷酸分子包括编码以下氨基酸序列的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中从约氨基酸位置1(Met)至约氨基酸位置286(Pro)的氨基酸序列。在非限制性实施方案中，这种多核苷酸分子分别包括从SEQ ID NO:1中约核苷酸位置120至约核苷酸位置980的核苷酸序列或从SEQ ID NO:3中约核苷酸位置121至约核苷酸位置981。在进一步的非限制性实施方案中，本发明的多核苷酸分子分别包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
本发明进一步提供了编码PauA蛋白与本发明多核苷酸分子基本上同源的多核苷酸分子。
本发明进一步提供了包括以下核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码与本发明多核苷酸分子编码的PauA蛋白基本上同源的多肽。
本发明进一步提供了这样的多核苷酸分子，其由编码PauA蛋白的肽段的核苷酸序列或编码与本发明多肽基本上同源的肽段的核苷酸序列所组成。在具体但非限制性的实施方案中，本发明提供了由以下核苷酸序列所组成的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码由来自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸的子序列所组成的肽段，其中的子序列选自约位置28至约位置286的氨基酸、约位置104至约286的氨基酸、约位置172至约位置286的氨基酸、约位置28至约位置170的氨基酸、约位置104至约位置170的氨基酸、约位置104至约208的氨基酸、约位置172至约位置208的氨基酸、位置约28至约位置103的氨基酸、约位置28至约位置208的氨基酸及约位置149至约位置286的氨基酸。
本发明进一步提供了包括以下核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码包括的融合蛋白连接上载体或融合部分的本发明PauA蛋白、基本上同源的多肽或肽段。
本发明进一步提供了用作扩增技术中引物及不同疾病诊断探针的寡核苷酸分子。在非限制性实施方案中，本发明的寡核苷酸分子由SEQ ID NOS:13-27及其互补核苷酸序列所组成。在进一步非限制性的实施方案中，本发明的寡核苷酸分子包括SEQ ID NOS:13-27及其互补的核苷酸序列。
本发明进一步提供了且合物及用于重组表达本发明多核苷酸分子的方法，包括重组克隆载体及包括该多核苷酸分子的重组表达载体及以任何所述载体转化的宿主细胞系。
本发明进一步提供了由本发明多核苷酸分子编码的重组表达PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段或融合蛋白。
本发明进一步提供了本发明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段或融合蛋白的类似物及衍生物。
本发明进一步提供了用于保护哺乳动物种类成员免患乳腺炎的疫苗，其中包括能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎保护反应的免疫学上有效量的本发明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子及兽医上可接受的载体。疫苗可任选包括佐剂或其它免疫调节成分。
在非限制性的实施方案中，本发明的疫苗是用于保护哺乳动物种类成员抵抗乳腺炎及任选可折磨哺乳动物的一种或更多种其它疾病或病理状态的组合疫苗，该组合疫苗包括能在哺乳动物中诱导保护性应答的本发明免疫学有效量的第一种成分，包括PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子；免疫学有效量的第二种成分，包括能够诱导抵抗能够折磨哺乳动物的疾病或病理学状态的抗原；以及兽医上可接受的载体。
本发明进一步提供了制备用于保护哺乳动物种类成员免患乳腺炎疫苗的方法，包括将能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎保护性反应的本发明免疫学有效量的PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子与兽医上可接受的载体组合。
本发明进一步提供了接种哺乳动物种类成员防止乳腺炎的方法，包括将本发明的疫苗施用到哺乳动物。
本发明进一步提供了特异性结合本发明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物或衍生物的抗体。
本发明进一步提供了疫苗试剂盒和诊断试剂盒。


图1根据乳房链球菌C216株PauA蛋白的肽段设计的寡聚探针(SEQ IDNos:13-25)。
图2培养于进一步含有牛纤溶酶原脱脂琼脂糖平板上的以乳房链球菌95-140株PauA基因转化的大肠杆菌DH5α分离株。清亮区源于纤溶酶原向纤溶酶的激活及随后奶蛋白的降解。
图3 pER318和pER319显示克隆的pauA插入子，其两侧具有HexA和HexB基因。
图4乳房链球菌c216菌株的双向终止子序列，其相邻于pauA基因的ORF，位于SEQ ID NO:1中的核苷酸978至1,088处。pauA ORF的终止密码子下被划线。
图5经SDS-PAGE分离并以考马斯亮蓝染色的预诱导和诱导的全细胞沉淀物裂解样品。1道=分子量标准(RAINBOW Kaleidoscope预染的标准，伯乐实验室)；2道=预诱导的菌株Pz326(含有质粒pER326，具有信号序列)；3道=后诱导的菌株Pz326；4道=预诱导的菌株Pz328(含有质粒pER328，无信号序列)；5道=后诱导的菌株Pz328；6道=预诱导的菌株Pz330(含有质粒pER330，具有信号序列)；7道=后诱导的菌株P2330；8道=预诱导的菌株P2332(含有质粒pER332，无信号序列)；9=后预导的菌株Pz332；10道=从乳房链球菌95-140株纯化的PauA蛋白。
图6经SDS-PAGE分离并用Western印迹分析的预诱导和诱导的全细胞裂解沉淀物样品。除了10道=乳房链球菌菌株95-140外，其余各道与图5相同。一级抗体为鼠单克隆抗体EC-3，且二级抗体为交联到BCIP上的羊抗鼠抗体。
编码纤溶酶原激活蛋白的多核苷分子本发明供了包括编码有生物活性纤溶酶原激活蛋白(这里命名为“PauA蛋白”，以前称“PA”或“链激酶”)核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。如这里所使用的，术语“生物活性”指将哺乳动物纤溶酶原转变为纤溶酶的能力。由本发明多核苷酸分子所编码的PauA蛋白可以是与源自任何产生PauA蛋白有机体相同的PauA蛋白，但优选源自导致或有助于哺乳动物种类成员乳腺炎的细菌。在优选的实施方案中，链球菌属细菌，更为优选的乳房链球菌或停乳链球菌能够将牛纤溶酶原转化为纤溶酶。
如这里所使用的，术语“多核酸分子”、“编码序列”、“多核苷酸序列”、“开放阅读框(ORF)，”等意指DNA和RNA分子，其可以是单链或双链，且当置于适当调节元件的控制下在合适的宿主细胞表达系统中可被转录和翻译(DNA)，或翻译(RNA)成相应的PauA蛋白或多肽，它们与PauA蛋白或前述的PauA蛋白或基本上同源的多肽、或融合蛋白或类似物的肽段基本同源。编码序列的界线一般由存在于5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子所决定。编码序列可包括但不限于原核序列、cDNA序列、基因组DNA序列，及化学合成的DNA及RNA序列。如这里所用的，术语“ORF”指编码本发明的PauA蛋白、基上同源的多肽、肽段、融合蛋白或类似物所需的无任何中间终止密码子的最少核苷酸序列。
推导的乳房链球菌C216和95-140株天然PauA蛋白的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。列于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4中的每种推导氨基酸序列的起始25个氨基酸似乎代表由各自PauA基因所编码的信号序列，该信号序列在细胞加工过程中被去除以产生分泌(成熟)的PauA蛋白。因此，在优选的实施方案中，本发明分离的多核苷酸分子包括编码PauA蛋白的核苷酸序，该PauA蛋白包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中从约氨基酸位置26(ILe)至约氨基酸位置286(Pro)的氨基酸序列。
两种不同多核苷酸(DNA)分子编码序列的核苷酸(第一种编码乳房链球菌C-216株的PauA蛋白，且第二种编码乳房链球菌95-140株的PauA蛋白)分别列于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:1核苷酸序列具有120-980核苷酸的ORF。SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有121-981核苷酸的ORF。考虑进去肽信号序列的去除，在本发明非限制性多核苷酸分子实施方案中分别包括SEQ ID NO:1中约195～977位置，或SEQ ID NO:3中约196～978位置的核苷酸序列。
在更为优选的实施方案中，本发明的多核苷酸分子包括编码下面氨基酸序列的核苷酸序列，该氨基酸序列包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中约氨基酸位置1(Met)至约氨基酸位置286(Pro)的氨基酸序列。在进一步非限制性的实施方案中，本发明的多核苷酸分子分别包括SEQ ID NO:1中约核苷酸位置120至约核苷酸位置980的核苷酸序列，或SEQ ID NO:3中从约核苷酸位置121至约核苷酸位置981的核苷酸序列。在进一步非限制性的实施方案中，本发明的多核苷酸分子分别包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸分子可进一步包括位于这里所列的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3两侧的核苷酸序列。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，其与编码PauA蛋白本发明的多核苷酸分子基本同源。这里称多核苷酸分子所用的术语“基本上同源”指包括下面核苷酸序列的多核苷酸分子(a)与包括以下核苷酸序列的多核苷酸分子编码相同PauA蛋白的核苷酸序列，即SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至核苷酸位置977的核苷酸序列或SEQ ID NO:3中核苷酸位置196至核苷酸位置978的核苷酸序列，但基本同源的多核苷酸分子由于遗传密码子的简并而包括核苷酸序列中一个或更多个沉默突变；和/或(b)与SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至核苷酸位置977的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3中核苷酸位置196至核苷酸位置978的核苷酸序列至少有约70％，更为优选至少约80％且最优选至少约90％相同的核苷酸序列，且其在实现本发明中是有用的；和/或(C)与下列DAN分子在适当严格条件下杂交的核苷酸序列，该DNA分子包括与SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至核苷酸位置977的核苷酸序列或SEQ ID NO:3中核苷酸位置196至核苷酸位置978核苷酸序列互补的核苷酸序列，即在0.5MNaHPO4、7％十二烷基磺酸钠(SDS)、1mMEDTA于65℃与滤膜结合的DNA杂交，并于42℃于0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(见Ausubel等(编)，1989，当前分子生物学方法，1卷，GreenPublishing Associates,Inc.,and John Wiley&Sons,Inc.,NewYork,atp.2.10.3)，用该核苷酸序列在实现本发明中是有用的。在优选的实施方案中，该基本上同源的多核苷酸分子在高度严格的条件下与下面的DNA分子杂交，此DNA分子包括互补于SEQ ID NO:1中核苷酸位置195至977的核苷酸序列或SEQ IDNO:3中核苷酸位置196至978的核苷酸序列的核苷酸序列，即在0.5MNaHPO4、7％SDS 1mMEDTA于65℃与滤膜结合的DNA杂交，并以0.1×SSC/0.1％SDS于68℃洗涤(Ausubel等，1989上述)，且该序列在实现本发明中是有用的。
如这里所用的，多核苷酸分子“在实现本发明中是有用的”，其中的多核苷酸分子或者(a)编码具有生物活性的多肽，即，可将哺乳动物的纤溶酶原转变为纤溶酶；或(b)编码免疫原性的多肽，即当施用至哺乳动物成员时能够诱导抗乳腺炎的保护性反应；或(c)编码当施用至哺乳动物种类成员时能够诱导PauA蛋白特异性抗体产生的多肽；或(d)可以用作诊断试剂以通过检测感染哺乳动物组织或体液样品中病原体-特异性多核苷酸分子的存在而检测致乳腺炎病原体如乳房链球菌对哺乳动物的感染。
本发明进一步提供了包括下面核苷酸序列的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码与本发明多核苷酸分子编码的PauA蛋白基本上同源的多肽。
这里对多肽所使用的术语“基本上同源”指包括下面氨基酸序列的多肽(a)与包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4约氨基酸位置26至约286氨基酸序列的PauA蛋白氨基酸序列有至少约50％，优选至少约70％，且最优选至少约80％的相同性，且在实现本发明中是有用的氨基酸序列；和/或(b)或者与包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白的氨基酸序列相同的氨基酸序列，但其中的一个或更多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基保守地替代(conservativelysubstituted)，其中的这种保守性替代导致在实现本发明中有用的多肽；和/或(c)或者与包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白氨基酸序列相同的氨基酸序列，但其中的一个或更多个氨基酸被不同的氨基酸残基非保守地替代，其中的这种非保守性替代导致了在实现本发明中有用的多肽。
保守性氨基酸替代在本领域众所周知，例如，本发明天然PauA蛋白的一个或更多个氨基酸残基可用相似电荷、大小或极性的氨基酸残基保守地替代，得到的多肽在实现本发明中仍然是有用的。进行这种替代的规则包括由Dayhof,M.D 1978，国立生物医学研究基金会，华盛顿特区，5卷，增刊3及其它文献，描述的规则。更为具体地说，保守性氨基酸的替代为那些一般发生于侧链相关的一族氨基酸内的替代。遗传编码的氨基酸一般分为四组(1)酸性的=天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性的=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性的=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性的=甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同归为芳香氨基酸。在倒可特定组中一个或更多个替代，如，以异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸，或以谷氨酸替代天冬氨酸，或从丝氨酸替代苏氨酸，或任何其它氨基酸残基以结构上相关的氨基酸残基的替代一般对得到多肽的功能没有显著的影响。
如下表1中6.7部分中所总结的，当比较乳房链球菌C216株(SEQ IDNO:2)与95-140株(SEQ ID NO:4)PauA蛋白的推导的氨基酸序列时，观察到几种具体的非保守性氨基酸替代的实例。例如，乳房链球菌C216株PauA蛋白73位置的氨基酸为天冬氨酸(酸性)，而乳房链球菌95-140株的该氨基酸为天冬酰胺(中性，极性)。此外，乳房链球菌C216株PauA位置115和124处的氨基酸为谷氨酰胺(中性，极性)，而乳房链球菌95-140株该氨基酸为精氨酸(碱性)。此外，乳房链球菌C216株PauA位置211处的氨基酸为亮氨酸(非极性)，而乳房链球菌95-140株的该氨基酸为精氨酸(碱性)。此外，乳房链球菌C216株PauA位置242处的氨基酸为组氨酸(碱性)，而乳房链球菌95-140株的该氨基酸为天冬氨酸(酸性)。
如这里所使用的，多肽“在实施本发明中是有用的”，其中的多肽或者(a)是具有生物活性的，即可将哺乳动物纤溶酶原转变为纤溶酶；或(b)是具有免疫原性的，即当施用到哺乳动物种类成员时能够诱导抗乳腺炎的保护性反应；或(c)当施用至哺乳动物种类成员时能够诱导抗-PauA蛋白特异性抗体的产生，其中的抗体作为诊断试剂是有用的；或(d)可用作诊断式剂以检测由于感染致乳腺炎病原体如乳房链球菌或由于种痘本发明疫苗而存在于哺乳动物血液或血清样品中的抗-PauA蛋白特异性抗体。
本发明进一步提供了由编码PauA蛋白肽段或本发明基本上同源多肽的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子。如这里所使用的，术语“肽段”指由PauA蛋白或本发明基本上同源多肽的氨基酸子序列所组成的多肽，其中的子序列长度短于全长PauA蛋白或基本上同源的多肽，且其在实现本发明中是与上面定义的多肽一样有用。因此，当全长PauA蛋白或基本上同源的多肽代表具有“n”个氨基酸残基时，其肽段将是任何短于全长PauA蛋白或基本上同源多肽的多肽，包括具有n-1个氨基酸残基的多肽，其中的肽段在实现本发明中是有用的。本发明的肽段优选至少长约7-10个氨基酸残基。在更为优选的实施方案中，该肽段包括代表PauA蛋白表位的氨基酸序列。
在具体但无限制的实施方案中，本发明提供了由以下核苷酸序列所组成的多核苷酸分子，该核苷酸序列编码由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中下面氨基酸子序列所组成的肽段，包括约氨基酸位置28至约286、约104至286、约172至约286、约28至约170、约104至约170、约104至约208、约172至约208、约28至约103、约28至约208、及约149至约286的子序列。
当编码的肽段包括一个以上PauA蛋白或其基本上同源多肽的子序列时，可对编码该肽段的多核苷酸分子进行没计从而使几个子序列连到一起并使这些在天然PauA蛋白或基本上同源的多肽中以前不相邻的子序列在肽段中彼此邻近。与本发明全长PauA蛋白或基本上同源多肽相比具有一个或更多个内部氨基酸缺失的多肽按照此定义也被认为是肽段，且包括在本发明的范围之内。此外，可对编码本发明肽段的多核苷酸分子进行设计从而使包括由此编码肽段的不同子序列与天然蛋白或基本同源的多肽相比以相互间不同的相对顺序进行组织。在优选的实施方案中，该多核苷分子编码一个或更多个本发明PauA蛋白或基本上同源多肽的子序列，其中的子序列代表一个或更多个能在哺乳动物种类成员中产生中和抗体的PauA蛋白或基本上同源多肽的表位区。本发明也打算包括编码全长(n)PauA蛋白或其基本上同源多肽的多核苷酸分子，其中的氨基酸子序列相互间顺序被重排。
本发明进一步提供了包括编码融合到多肽载体或融合部分以形成融合蛋白的本发明PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的核苷酸序列的多核苷酸分子。本发明多核苷酸分子编码的融合蛋白非限制性实例包括β-半乳糖苷酶融合体、trpE融合体、麦芽糖-结合蛋白融合体、谷胱苷肽-S-转移酶(GST)融合体和多组氨酸融合体(载体区域)。在具体但非限制性的实施方案中，本发明提供了编码融合到本发明肽段的GST的多核苷酸分子，其所述的肽段由下面SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中的子序列所组成，包括约氨基酸位置28至286，约104至286，约172至286，约28至170，约104至170，约104至208，约172至208，约28至103，约28至208，约149至286的氨基酸序列。本领域已知的方法可用于构建具有编码这些和其它融合蛋白核苷酸序列的多核苷酸分子。
除非另有说明，否则后面提及的“PauA多肽”意在包括本发明前述的PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段及融合蛋白。
本发明进一步提供了与本发明任何前述多核苷酸分子杂交，或与具有与本发明任何前述多核苷酸分子互补核苷酸序列的多核苷酸分子杂交的寡核苷酸分子。这种寡核苷酸分子优选至少长约10至15个核苷酸，但可延伸至SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3中任何子序列的长度，且在中等或高度严格条件下可与一种或更多种前述的多核苷酸分子杂交。对于更短的寡核苷酸分子，高度严格的条件实例包括以6×SSC/0.5％焦磷酸钠，对于-14碱基寡聚体在约37℃洗涤，对于-17碱基寡聚体于约48℃洗涤，对于-20碱基寡聚体于约55℃洗涤且对于-23碱基寡聚体于约60℃洗涤。对于更长的寡核苷酸分子(即大于约100个核苷酸)，对于基本同源的多核苷酸分子，中等和高度严格的条件如上述。本领域众所周知，根据所用的特定寡核苷酸分子，杂交条件可适当调整。
在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸分子在高度严格的条件下与由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3核苷酸序列所组成的多核苷酸分子杂交，或与由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3核苷酸序列互补的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子杂交。
在非限制性的实施方案中，本发明的寡核苷酸分子由SEQ ID NOS:13-27及其互补的核苷酸序列所组成。在进一步非限制性的实施方案中，本发明的寡核苷酸分子包括SEQ ID NOS:13-27及其互补的核苷酸序列。
本发明的寡核苷酸分子可用于多种目的，包括，如在不同疾病诊断中用作扩增编码PauA蛋白多核苷酸分子的引物，或编码或用作基因调节中的反义分子。扩增可用于检测感染动物组织或体液样品中，如哺乳动物乳汁中编码PauA蛋白的多核苷酸分子的存在。特异扩增产物的产生表示细菌感染的存在，而没有扩增产物可表示没有感染产生。
虽然本领域已知的其它扩增技术，如连接酶链式反应也可使用，但扩增可用适当设计的寡核苷酸分子结合标准的技术，如聚合酶链式反应技术(PCR)完成。例如，对于PCR，制备包括适当设计的引物、包括待扩增核苷酸序列的模板及适当的PCR酶和缓冲液的混合物并根据标准的方法进行以扩增特异PauA-相关的模板多核苷酸序列。
本发明多核苷酸分子及寡核苷酸分子的制备和操作属本领域的技术范畴且可根据下面及其它地方描述的重组技术完成，包括Maniatis等.,1989，分子克隆，实验指南，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel，等，1989，当前分子生物学方法，Green Publishing Associates&Wiley Inter Science，纽约；和Sambrook，等，1989，分子克隆，实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，所有文献在此引用仅供参考。进行PCR的方法在如下及其它文献中已有描述，如，Innis等(编)，1995，PCR策略，学术出版公司，圣地亚哥；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，纽约，在此引用仅供参考。
重组表达系统表达载体本发明进一步提供了包括本发明多核苷酸分子的重组克隆载体和重组表达载体。优选构建表达载体从而使该多核苷酸分子编码序列(以下称“PauA编码序列”)与一个或更多个对PauA编码序列转录和翻译以产生多肽所必需的调节元件可操作地连接。
如本文所使用的，术语“调节元件”包括但不限于本领域已知的编码可诱导和不可诱导启动子、增强子、操纵子及其它元件的核苷酸序列，这些序列用于驱动和/或调节多核苷酸编码序列的表达。同样，如这里所用的，PauA编码序列也与一种或更多种调节元件“可操作地连接”，其中的调节元件有效地调节和使PauA编码序列转录或其mRNA的翻译或二者兼而有之。
已知有多种表达载体，优选那些含有对指导PauA编码序列复制、转录和翻译所必需的调节元件的那些表达载体，且它们可用于表达PauA编码序列。表达载体包括含有用于转化细菌或酵母PauA编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA和粘粒DNA表达载体；重组病毒表达载体，如含有用于转染昆虫细胞PauA编码序列的杆状病毒；和重组病毒表达载体，如含有用于转染动物细胞PauA编码序列的腺病毒或痘苗病毒，等。
可经加工而含有本发明PauA编码序列的典型原核表达载体质粒包括pUC8、pUC9、pBR322及pBR329(伯乐实验室，Richmond,CA)和pPL及pKK223(发码西亚，Piscataway,NJ)，等其它质粒(among many ofhers)。
用于构建含有与适当调节元件可操作地连接的特定编码序列的表达载体方法在本领域是众所周知的，且这些方法可用于实现本发明。这些方法包括体外重组技术、合成技术及体内遗传重组。见如上面Maniatis等；Ausubel等，1989；及Sambrook等，1989描述的技术。
这些载体的调节元件在它们的长度和特异性上可以不同。根据所用的宿主/载体系统，可使用任何数目合适的转录和翻译元件。例如，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用从哺乳动物细胞基因组分离的启动子，如，小鼠金属硫蛋白启动子，或从这些细胞中生长的病毒中分离的启动子，如，痘苗病毒7.5K启动子或Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复序列。通过重组DNA或合成技术而获得的启动子也可用于提供插入序列的转录。此外，当特定诱导物存在时，如对于金属硫蛋白，锌和镉存在时，某些启动子的表达可被提高。
转录调节区或启动子的无限制实例包括，对于细菌的β-gal启动子、T7启动子、TAC启动子、入左右启动子(入left and right promoters)trp和lac启动子、trp-lac融合启动子等；对于酵母的糖酵解酶启动子，如ADH-Ⅰ和-Ⅱ启动子、GPK启动子、PGI启动子、TRP启动子等；对于哺乳动物细胞的SV40早期及晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子等。
插入PauA编码序列足够翻译也需要特定的起始信号。这些信号一般包括ATG起始密码子和相邻的序列。当整个PauA基因，包括其自身的起始密码子和相邻序列，插入到适当的表达载体时，无须额外的翻译控制信号。然而，当仅有部分编码序列插入时，外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子可能是需要的。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可获自多种天然和合成的来源。此外，起始密码子必须与PauA编码序列的阅读框一致以确保整个插入子的框内翻译。
融合蛋白表达载体可用于表达包括融合到载体或融合部分的PauA蛋白、基本上同源的多肽或肽段的融合蛋白。纯化的融合蛋白可用于，如，产生抗PauA蛋白的抗血清而用作诊断试剂以研究PauA蛋白的生化特性，将PauA融合蛋白加成不同的生物活性，或帮助鉴定或纯化表达的PauA蛋白。可能的融合蛋白表达载体包括但不限于编码β-半乳糖苷酶和trpE融合、麦芽糖结合蛋白融合、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合及多组氨酸融合(载体区域)的载体插入序列。GST-肽段融合的具体实例已在上面5.1部分中描述过，且本发明提供包括具有编码每种这些融合核苷酸序列的多核苷酸序列。本领域已知的方法可用于构建编码这种PauA融合蛋白的表达载体。
可将PauA融合蛋白加工成包括对于纯化有用的区域。例如，PauA-麦芽糖-结合的蛋白融合体可用直链淀粉树脂纯化；PauA-GST融合蛋白可用谷胱甘肽-琼脂糖小珠加以纯化；且PauA-多组氨酸融合可用二价的镍树脂纯化。或者，抗载体蛋白或肽的抗体可用于亲和层析纯化融合蛋白。例如，编码单克隆抗体靶表位(target epitope)的核苷酸序列可加工成与调节元件可操作连接的表达载体并被定位从而使表达的表位融合到融合蛋白的PauA部分上。例如，编码FLAGTM表位标记(tag)(国际生物技术公司)的核苷酸序列(一种亲水标记肽)可通过标准的技术插入到表达载体中相应于PauA部分氨基或羧基末端的位点。然后可用商业上可得到的抗-FLAGTM抗体检测和亲和纯化表达的PauA-FLAGTM表位融合产物。
表达载体也可被加工成含有多接头序列，该多接头序列编码特异的蛋白酶切割位点从而使表达的PauA部分可通过用特异蛋白酶的处理而从载体区域或融合部分释放出来。例如，融合蛋白载体可包括编码凝血酶或因子Xa的切割位点的DNA序列等。
PauA编码序列上游及阅读框内的信号序列可用已知方法被加工人表达载体以指导表达蛋白的运输和分泌。信号序列无限制的实例包括那些来自α-因子、免疫球蛋白、外膜蛋白、青霉素酶、T-细胞受体、以及来自PauA蛋白本身的信号序列等。
为了便于筛选从本发明表达载体转化或转染的宿主细胞，可将表达载体加工成进一步包括报告基因或其它可选择标记的编码序列。这种编码序列优选与上述调节元件编码序列可操作地连接。在实现本发明中有用的报告基因在本领域中已众所周知且包括那些编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白、荧火虫荧光素酶及人类生长激素等的基因。编码可选择标记的核苷酸序列在本领域众所周知，并且包括那些编码赋予对抗生毒或抗代谢物抗性的核苷酸序列或提供营养缺陷需求的核苷酸序列。这种序列的实例包括那些编码胸苷激酶活性或对氨甲蝶呤、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或Zeocin等具有抗性的核苷酸序列。
宿主细胞的转化本发明进一步提供了以本发明重组克隆或表达载体转化的宿主细胞及其衍生的细胞系。在实现本发明中有用的宿主细胞可或者为原核的或者为真核的。这种转化的宿主细胞包括但不限于微生物，如以重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌，或从重组表达载体转化的酵母；或动物细胞，如以重组病毒表达载体，如杆状病毒转染的昆虫细胞，或以重组病毒表达载体，如腺病毒或痘苗病毒转染的哺乳动物细胞等。
细菌一般优选作为宿主细胞。一般可用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株，可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC),Rockville,MD，美国(许可号31343)或商业来源(Stratagene)，或TAP56或LW14株(大肠杆菌Pfizer室内(in-house)株)。虽然也可有效地利用来自如小鼠、仓鼠、牛、猴、或人成纤维细胞系的哺乳动物细胞，但优选的真核宿主细胞包括酵母细胞。可用于表达本发明重组PauA多肽的真核宿主细胞实例包括中国仓鼠卵母细胞(CHO)(如，ATCC许可号CCL61)及NIH SWiss小鼠胚胎细胞NIH/3T3(如.ATCC许可号CRL 1658)。
本发明的重组载体优选转化或转染进入基本上均一细胞培养物的一种或更多种宿主细胞中。载体一般根据已知的技术导入宿主细胞，如通过磷酸钙沉淀、氯化钙处理、显微注射、电穿孔、以重组病毒接触的转染、脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖转染、转导、接合、或微粒轰击。转化子的筛选可通过标准方法进行，如通过筛选表达可选择标记的细胞，如与重组载体有关的抗生素抗性。
一旦本发明的重组载体导入到宿主细胞内时，可通过标准的技术，如通过Southern杂交分析、限制性酶分析、PCR分析，包括反转录酶PCR(rt-PCR)，或通过免疫学分析来确证PauA编码序列在宿主细胞基因组中或附加的整合和维持以检测预期的多肽产物。含有和/或表达重组PauA编码序列的宿主细胞可通过至少4种普通方法中任何一种加以鉴定，这些方法在本领域中众所周知，包括(ⅰ)DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-反义RNA杂交；(ⅱ)检测“标记”基因功能的存在；(ⅲ)评估通过在宿主细胞中表达PauA-特异性mRNA转录本而测得的转录水平；和(ⅳ)通过如免疫分析或PauA生物活性的存在(即将适当的哺乳动物纤溶酶原转变为纤溶酶)检测成熟PauA多肽产物的存在。
在非限制性的实例中，重组表达PauA多肽的生物活性可用，如，国际专利公开WO 93/14209中描述的琼脂糖/去脂奶粉重叠分析(overlay assay)通过检测牛纤溶酶原至纤溶酶的转换加以检测。简言之，将待测PauA生物活性的制品稀释到合适的浓度，如，1μg蛋白/ml磷酸缓冲盐(PBS)(PH7.4)，并加入到切成琼脂糖(1％w/v在PBS)片的小孔(a well cut into a sheet of agarose)中，其中的琼脂糖含有OxordTM脱脂牛奶(1％w/v；Uniparn Ltd.,Hampshire,England)和牛纤溶酶原(10-3单位/ml)(Sigma)。通过观察脱脂牛奶层中清亮区的形成检测有生物活性PauA多肽的存在，清亮区形成表示牛纤溶酶原转变为纤溶酶后牛奶蛋白的降解。或者，可使用在下面7.3部分中描述的显色分析。
重组多肽的表达和特征描述一旦PauA编码序列被稳定地导入适当的宿主细胞时，将转化的宿主细胞克隆扩增，并将得到的细胞在有利于PauA多肽最大产量的条件下培养。这种条件一般包括培养细胞至高密度。当需要诱导表达时，只要表达载体包括可诱导的启动子，可用适当的诱导条件，如温度变迁、营养物耗竭、添加义务诱导物(如碳水化合物类似物，例如异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG))、过量代谢副产物的积累等。
收获和裂解其中含有表达PauA多肽的宿主细胞，并在本领域已知的提取条件下，如4℃或蛋白酶抑制剂存在下或两者条件下从裂解物中分离和纯化产物以最大限度地降低蛋白降解。只要表达的PauA多肽从宿主细胞中分泌，仅可收集耗竭营养物的培养基并从其中分离产物。
用标准方法可适当地从细胞裂解物或培养基中基本上纯化或分离表达的PauA多肽，包括但不限于下面方法的任何组合硫酸铵沉淀、大小分离、离子交换层析、HPLC、密度离心及吸附层析。只要表达的PauA多肽显示出生物学活性，即激活纤溶酶原的能力，可用分析方法，如上述的琼脂糖/脱脂牛奶重叠分析，或下面7.3部分中所述的显色分析或通过任何其它检测纤溶酶原激活的相关分析在纯化方法中的每一步监测该制品逐渐增加的纯度。如果表达的多肽缺乏生物学活性，可根据，如大小，或与PauA多肽其它特异性抗体的反应性或通过融合标记的存在而对其进行检测。
因此，本发明进一步提供了在有利于PauA多肽产生的条件下用于制备PauA多肽及从细胞培养物中回收PauA多肽的方法，前者包括培养以重组表达载体转化的宿主细胞，所述的重组表达载体包括含有编码下面物质核苷酸序列的多核苷酸分子(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中约从氨基酸位置26至约286的氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)与PauA蛋白基本同源的多肽；或(c)PauA蛋白或基本上同源多肽的肽段；或(d)包括PauA蛋白、基本上同源的多肽、或融合到融合部分肽段的融合蛋白，其中的多核甘酸分子与控制宿主细胞中多核苷酸分子表达的一种或更多种调节元件可操作地连接。
一旦获得足够纯度的PauA多肽，其可通过标准的方法加以特征描述，包括SDS-PAGE、大小排阻层析、氨基酸序列分析、将纤溶酶原转换为纤溶酶的生物活性等。PauA多肽的氨基酸序列可用标准的肽测序技术加以测定。PauA多肽可进一步用亲水分析(见，如.，Hoop和Woods,1981，美国自然科学院院刊78:3824)或类似的计算公式进行特征描述以鉴定PauA多肽的疏水和亲水区。可进行结构分析以鉴定PanA多肽恢复特异二级结构的区域。生物物理方法如X-射线晶体学(Engstrom,1974，生化实验生物学11:7-13)，计算机模拟(Fletterick和Zoller(编)，1986，于当前分子生物学通讯，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)和核磁共振(NMR)可用于作图及对与PauA多肽和其底物相互作用的位点进行研究。从这些研究获得的信息可用于设计更为有效的疫苗组合物、筛选仅包括PauA多肽特异部分的疫苗或设计或筛选可阻止天然PauA蛋白对纤溶酶原激活的治疗或药物化合物。
在实现本发明中有用的PauA多肽为(a)具有生物活性的多肽，即可将哺乳动物纤溶酶原转变为纤溶酶；或(b)具有免疫原性的多肽，即当施用到哺乳动物种类成员时能够诱导抗乳腺炎的保护性反应；或(c)当施用到哺乳动物种类成员时能够诱导抗-PauA蛋白特异性抗体的产生的多肽，其中的抗体作为诊断试剂是有用的；或(d)可用作检测哺乳动物血液或血清样品中抗-PauA蛋白特异性抗体存在的诊断试剂的多肽，其中的哺乳动物被致-乳腺炎病原体如乳房链球菌感染或经本发明的疫苗种痘过而得到。这种多肽，一旦制备，可用本领域已知的常规筛选方法加以鉴定。例如，可用一种这里描述的生物分析法测定将哺乳动物纤溶酶原转变为纤溶酶的能力。诱导抗乳腺炎保护性免疫反应的能力可通过下面方法加以鉴定，包括施用PauA多肽至对链球菌如乳房链球菌所致的乳腺炎易感的哺乳动物种类成员，并测试PauA中和抗体的存在，或种痘动物抵抗随后以致-乳腺炎病原体感染的能力。通过施用PauA多肽至模型动物，如小鼠、猪、绵羊、山羊、马、牛等并用标准的技术测试动物的血清转变可鉴定诱导产生特异性PauA蛋白抗体的能力。用PauA多肽作为诊断试剂的能力可通过以下方法加以测定，包括将每PauA多肽暴露于以前以致-乳腺炎病原体如乳房链球菌感染动物的血液或血清样品中，或以前以本发明疫苗种痘动物的血液或血清样品中，并用标准技术，如ELISA分析方法测定样品中PauA蛋白特异性抗体与PauA多肽的结合。
在实现本发明中有用的具体而无限制的PauA多肽实例包括含有SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中约氨基酸位置26至约286，或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中约氨基酸位置1至约286氨基酸序列的蛋白。
在实现本发明中有用的具体而无限制的PauA肽段实例包括由SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中下面的氨基酸子序列所组成的肽段，包括约28至286，约104至286，约172至286，约28至170，约104至170，约104至208，约172至208，约28至103，约28至208，约149至286的氨基酸。
在实现本发明中有用的具体而无限制的融合蛋白实例包括GST融合蛋白，其中包括融合到由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中下面的氨基酸子序列所组成的肽段上的GST，包括氨基酸位置约28至286，约104至286，约172至286，约28至170，约104至170，约104至208，约172至208，约28至103，约28至208和约49至286的氨基酸子序列。
本发明因此提供了基本上纯化或分离的PauA蛋白、其基本上同源的多肽、这种PauA蛋白和基本上同源多肽的肽段，和包括所述的PanA蛋白、基本上同源的多肽或肽段(这里统称为“PauA多肽”)的融合蛋白。
PauA的类似物和衍生物本发明进一步提供了前述PauA多肽的类似物和衍生物，其中的这种类似物和衍生物在实现本发明中是有用的、其用途与上述定义的多肽相同。
可在基因水平或蛋白水平或这两个水平上产生导致类似物产生的操作。在基因水平，如可通过一种或更多种已知的策略在体外修饰编码PauA多肽的克隆DNA分子以编码PauA蛋白类似物。这种修饰包括但不限于内切核酸酶消化，创造或毁坏翻译、起始和/或终止序列，或在长编码区域内创造变异或其任何组合的突变。见如上面的Maniafis，等，1989；上面的Ausubel等1989及上面的Sambrook等1989。可以使用本领域已知的用于诱变的任何技术，包括但不限于暴露于诱变剂如辐射或化学诱变剂或体外定点诱变(见如，Hutchinson等.,1978，生物化学杂志253:6551)。
对PauA多肽的操作也可在蛋白水平完成。可用已知的技术完成一种或更多种蛋白的化学修饰，包括但不限于以下任何一种技术以相应的D-氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸近似物(mimics)替代天然蛋白的一个或更多个L-氨基酸从而产生如Carbazates或tertiary centers；或特异的化学修饰，如以胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶或V8蛋白酶的蛋白水解切割，或以NaBH4或溴化氰处理或乙酰化、甲酰化、氧化或还原等。
可通过向其中交联上一个或更多个化学基团而衍生出PauA多肽，这些化学基团包括但不限于乙酰基、二硫桥基团、糖基、脂、和磷酸和/或别的PauA多肽或其它蛋白，如血清蛋白、匙孔血蓝蛋白或商业上激活的BSA或多氨基酸(如聚赖氨酸)或多糖(如琼脂糖凝胶，琼脂糖或修饰或未修饰的纤维素)等。这种交联优选通过与多肽N-未端或C-末端和/或氨基酸侧链共价连接。完成这种交联反应的方法在蛋白化学领域众所周知。
在完成本发明中有用的衍生物也包括那些其中的水溶性多聚体如聚乙二醇被交联到PauA多肽或其类似物或其它衍生物上，因而提供额外所需特性而同时至少部分保留多肽免疫原性的衍生物种类。这些额外所需的特性包括如，增加的水溶液中的溶解性、增加的贮存中的稳定性，增加的对蛋白降解的抗性及增加的体内半寿期。适于交联剂PauA多肽上的水溶性多聚体包括但不限于聚乙二醇同聚物、聚丙二醇同聚物，乙二醇与丙二醇的共聚物，其中所述的同聚物和共聚物在一末端以烷基，聚氧化乙烯醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多糖、聚乙醚(Polyvinyl ethyl ethers)和α,β-聚[2-羟乙基]-DL-天冬酰胺(α,β-poly[2-hydroxyethyl]-DL-aspartamide]。聚乙二醇为特别优选。制备蛋白的水溶性多聚体共轭物方法在本领域是已知的并在下面文献中有描述，包括美国专利3,788,948；美国专利3,960,830；美国专利4,002,531；美国专利4,055,635；美国专利4,179,337；美国专利4,261,973；美国专利4,412,989；美国专利4,414,147；美国专利4,415,665；美国专利4,609,546；美国专利4,732,863；美国专利4,745,180；欧洲专利(EP)152,847；EP98,110；和日本专利(JP)5,792,435,这些专利在此引用仅供参考。
在实现本发明中有用的类似物和衍生物可用上述用于PauA多肽的方法加以鉴定。
抗乳腺炎疫苗本发明进一步提供了用于保护哺乳动物种类成员抗乳腺炎的疫苗，其中包括免疫学有效量的(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4约氨基酸位置26至286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)与PauA蛋白基本上同源的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽的子序列所组成的肽段；或(d)包括PauA蛋白、基本上同源多肽或融合到融合部分肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的类似物或衍生物；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、或类似物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应；和兽医上可接受的载体。
在无限制的实施方案中，本发明的疫苗包括转化的宿主细胞，其中含有本发明的表达载体或多核苷酸分子，该表达载体或多核苷酸分子在宿主细胞中表达从而在哺乳动物中产生能够诱导抗乳腺炎保护性反应的本发明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白或类似物。该宿主细胞可以是本发明的表达载体或多核苷酸分子可以在其中表达的任何细胞且该细胞可以以疫苗形式施用到哺乳动物种类成员。在无限制的实施方案中，这种宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞。
如这里所使用的，术语“免疫学有效量”指免疫原的量，即当施用至哺乳动物时能够诱导抗乳腺炎的保护性反应的本发明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子。
这里广泛使用的术语“能够诱导保护性反应”包括在哺乳动物中诱导或增加任何基于免疫的对种痘的反应，包括用于保护种痘哺乳动物抵抗乳腺炎的抗体或细胞介导的免疫反应或这两种反应。这里使用的术语“保护性反应”和“保护”不限于绝对防止乳腺炎或绝对防止由致-乳腺炎病原体的感染，任意在包括与未种痘感染动物相比由病原体感染程度或速率的下降，或由病原体感染所致的疾病或任何症状或病情严重性的任何下降，包括任何可检测的牛奶产量的增加或任何可检测到的防止或延缓牛奶产量的减少。
如这里所使用的，术语“哺乳动物种类成员”和“哺乳动物”指可用本发明疫苗保护而免遭乳腺炎的任何哺乳动物种类或哺乳动物，包括牛种类(母牛和oxen)以及绵羊、猪、山羊、马、狗及猫的成员。
本发明的疫苗组合物可根据已接受的习惯用标准的缓冲液、载体、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂配制且也可配制成利于缓释的形式。稀释剂可包括水、盐、葡萄糖、乙醇、甘油等。用于等渗的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖等。稳定剂包括铝等。
佐剂可在疫苗中任选使用，其无限制的实例包括PIBI佐剂系统(RIbi公司)、明矾、氢氧化铝凝胶、水中油(Oil-in water)乳剂如水中鲨烯(Squolene-in-water)，油中水(water-in-oil)乳剂如Freund's完全和不完全佐剂，Block共聚物(CytRx,Atlanta GA),SAF-M(Chiron Emeryville CA),AMPHIGENR佐剂，皂苷，其它纯化或半纯化的皂苷部分如QuilA(Superfos)或QS-21(剑桥生物技术公司，剑桥马诸塞萨)，单磷脂A(monophosphoryllipid A)及Avridine脂胺佐剂。疫苗可进一步包括一种或更多种的其它免疫调节剂如白细胞介素、干扰素、或其它已知细胞因子。
适当的兽医上可接受的疫苗运载体(vehicle)载体(carriers)及添加剂是已知的，或将对本领域的技术人员是显而易见的；见，雷明顿的药物科学，第18版，1990,Mack出版社，在此引用仅供参考。该苗可以贮存于溶液中或冻干贮存从而在施用前重新调置于无菌稀释溶液中。
本发明进一步提供了用于免疫原缓释的疫苗制品。这种缓释制品的实例包括可与下列生物兼容的多聚体组合物结合使用的免疫原，如，聚(乳酸)、聚(乳-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid))、甲基纤维素、透明质酸、胶原蛋白等。药物运输载体中可降解多聚体的结构、筛选和使用已在几种出版物中综述过，包括A.Domb等.,1992，用于高技术的多聚体3:279-292，在此引用仅供参考。在M Chasin和R.Langer(编)，1990，“作为药物运载系统的可生物降解多聚体’位于药物和制药科学，45卷，M.Dekker，纽约的文章中也可找到其它有关药物制备中筛选和使用多聚体的指南，在此引用也仅供参考。作为选择或另外，本发明疫苗的PauA多肽、类似物、衍生物或多核苷酸可进行微囊化以提高施用和效率。用于微囊化抗原的方法在本领域众所周知，且包括下述的技术，如，美国专利3,137,631；美国专利3,959,457；美国专利4,205,060；美国专利4,606,940；美国专利4,744,933；美国专利5,132,117；和国际专利公开WO 95/28227，所有文献在此引用仅供参考。
脂质体也可用于提供本发明任何PauA多肽、类似物、衍生物或多核苷酸分子的缓释。关于如何制备和使用脂质体制剂的细节可发现于下面的文献中，包括美国专利4,016,100；美国专利4,452,747；美国专利4,921,706；美国专利4,927,637；美国专利4,944,948；美国专利5,008,050；和美国专利5,009,956，所有文献在此引用仅供参考。
在无限制的实施方案中，本发明的疫苗可以是用于保护哺乳动物种类成员抗能够折磨哺乳动物的乳腺炎和任选一种或两种以上其它疾病或病情的组合疫苗，其中的组合疫苗包括免疫学有效量的第一种成分，该成分包括a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中约氨基酸位置26至286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由Paua或基本上同源的多肽的子序列所组成的肽段；或(d)包括融合到融合部分的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、或融合蛋白的类似物或衍生物；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类以物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应；免疫学有效量的第二种成份，包括能够诱导抗能够折磨哺乳动物疾病或病情的保护性反应的抗原。
根据其诱导抗能够折磨哺乳动物的乳腺炎、或其它疾病或病情，或抗本领域已知的能够感染哺乳动物病原体保护性反应的能力筛选该组合疫苗第二种成份的抗原。已知任何在特定哺乳动物种类疫苗组合物中有用的免疫原性组合物可用于该组合疫苗的第二种成份。这些免疫原性的组合物包括但不限于那些提供抗下列病原体保护的种类，包括牛疱疹病毒(症状，感染性牛鼻气管炎(rhinotracheitis))、牛吸吸syncitial病毒、牛病毒性腹泻病毒、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ、钩端螺旋体属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属如金黄色葡萄球菌、链球菌属如无乳链球菌或停乳链球菌、枝原体属、克雷伯乐菌属、沙门氏菌属、轮犬病毒、冠形病毒、狂犬病、巴斯德氏菌属、如溶血巴斯德氏菌或多杀巴斯德氏菌、梭菌属、破伤风类毒素、大肠杆菌、Neospora spp.其它真核寄生虫等。
包括第二种成分的抗原可任选共价连接到第一种成分的PauA多肽、类似物或衍生物上以制备嵌合分子或融合蛋白。在无限制的实施方案中，第2种成分的抗原包括半抗原，其免疫原性通过交联到第一种成分的PauA多肽，类似物或衍生物上而有可检测到的增强。
包括共价连接的组合疫苗的第一和第二种成分抗原的嵌合分子可用本领域已知的一种或更多种技术加以合成。例如，嵌合分子可用商业上可得到的肽合成使用标准的化学合成方法(见，如Merrfield,1985，科学232:341-347)合成制备。或者，按本领域已知的技术单独合成分离的成分且然后通过化学交联键将其交联到一起。或者，嵌合分子可用重组DNA技术产生，其中，例如将包括编码不同嵌合分子抗原核苷酸序列的分离的多核苷酸分子在阅读框内拼接到一起并在合适的转化宿主细胞中表达用于随后嵌合分子的分离。当本发明的疫苗包括多核苷酸分子而不是多肽时，该拼接的多核苷酸分子可用于疫苗组合物中。完成该重组技术的有力指南在下列文献中提供，包括上面Maniatis等1989；上面的Ausubel等，1989；上面的Sambrook等，1989；上面的Innis等，(编)1995；及上面的Erlich,1992。
如上所述，本发明的疫苗可包括含有本发明表达载体或多核苷酸分子的转化宿主细胞，其中的表达载体或多核苷酸分子在宿主中表达以产生能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎保护性反应的本发明PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物。在进一步无限制的实施方案中，本发明的组合疫苗包括用作与任何除乳房链球菌所致乳腺炎以外疾病或病情相关病原体的宿主细胞，其中的疾病或病情可折磨哺乳动物，其中的宿主细胞进一步包括本发明的表达载体或多核苷酸分子，其中的表达载体或多核苷酸分子在宿主细胞中表达以制备本发明PauA蛋白，基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白或类似物，它们能在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应，且其中的宿主细胞用于诱导抗除乳房链球菌所致乳腺炎以外疾病或病情的保护性免疫反应。在无限制的实施方案中，这种宿主细胞选自钩端螺旋体属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属如金黄色葡萄球菌、链球菌属如无乳链球菌或停乳链球菌、支原体属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、巴斯德氏菌属如溶血巴斯德氏菌或多杀巴斯德氏菌、梭菌属、大肠杆菌、Neospora spp.及其它真核寄生虫。
本发明进一步提供了制备用于保护哺乳动物种类成员抗乳腺炎疫苗的方法，包括将免疫有效量的下面的物质组合a)包括SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4约氨基酸位置26至286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽子序列所组成的肽段；或(d)包括融合到融合部分的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的类似物或衍生物；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、或类似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应，与兽医上可接受的载体。
本发明进一步提供了种痘哺乳动物种类成员以抗乳腺炎的方法，包括施用本发明免疫学有效量的疫苗至哺乳动物。
施用于哺乳动物中免疫原的量依赖于下面的因素，如待种痘动物的种类、年龄、体重、健康及一般身体特征、以及待施用的特定免疫原性的和疫苗组合物。每种参数最佳剂量的测定可根据如经验性研究用常规方法完成。特别地关于本发明PauA多肽疫苗至牛种类成员的施用，施用的量将优选从约0.01μg至约100mg多肽，更为优选从约0.1μg至约10mg，且最优选从约1.0μg至约1mg。特别地关于本发明疫苗多核苷酸分子的向牛种类的施用，施用的量将优选从约0.05μg至约500mg多核苷酸，更为优选从约0.5μg至约50mg，且最优选从约5.0μg至约5mg。此外，疫苗的典型剂量体积将从约50μl至约50ml每剂量每只动物。
也可根据上述因素筛选疫苗的摄入法。动物可在任何合适的时间接种，包括断奶期或更年轻时期，或刚繁殖前或繁殖期，生产期，断奶期，或乳腺炎感染第一次开始在牧群中的一个或多个成员中出现。补充施用或加强免疫可能是必须的以完成完全的保护。例如通过测定血清转换或通过用中和分析测定是否完成充足的免疫保护方法在本领域是已知的。
本发明疫苗可通过任何下面合适的途径施用，如口腔、鼻内、肌肉内、乳房内(intrammary)、淋巴结内、腹膜内、静脉内、动脉内、皮下、直肠(rectal)或阴道施用，或几种途径结合施用。根据选择的途径技术人员将容易地制备疫苗组合物。
本发明进一步提供了用于种痘哺乳动物种类成员抵抗乳腺炎的疫苗试剂盒，包括含有免疫学有效量下面物质的第一只容器(container):a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中约氨基酸位置26至约286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽子序列所组成的肽段；或(d)包括融合到融合部分的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的类似物或衍生物；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白或类似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应；和包括兽医上可接受的载体或稀释剂的第二种容器。
抗-PauA抗体的制备本发明提供了结合本发明PauA多肽、类似物或衍生物的多克隆及单克隆抗体。这种抗体可用作亲和试剂，用它纯化天然或重组PauA多肽；或用如ELISA或Western印迹分析检测感染哺乳动物如组织切片或细胞、组织或体液样品中PauA蛋白的存在；或在治疗上用于中和感染动物中的天然PauA蛋白活性。
可产生抗本发明PauA多肽、类似物或衍生物中任何一种的抗体。根据已知的方法可用各种宿主动物，包括但不限于牛、马、兔、山羊、绵羊及小鼠制备抗PauA蛋白特异性的抗体。各种佐剂，如列于上面5.4部分中的佐剂可用于增强抗体的产生。
多克隆抗体可获自免疫动物并用标准技术测试抗-PauA多肽特异性。或者，用任何提供通过连续细胞系的培养而制备抗体分子的技术可制备PauA多肽的单克隆抗体。这些包括但不限于最初由Kohler和Milstein等所述的杂交瘤技术(自然，1975,256:495497)；人类B-细胞杂交瘤技术(Kosbor,等.,1983，今日免疫学4:72；Cote等，1983，美国自然科学院院刊80:2026-2030)；和EBV-杂交瘤技术(Cole等1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss.公司，77-96页)。或者，所述用于制备单链抗体的技术(见，如美国专利4,946,778)可用于制备PauA多肽-特异性单链抗体。这些出版物在此引用仅供参考。
含有本发明PauA多肽、类似物或衍生物特异性结合位点的抗体片段也包括在本发明范围内，并可用已知的技术产生。这种片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化完整的抗体分子而产生的F(ab’)2片段，和通过还原F(ab’)2片段二硫桥而产生的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库(Huse等1989，科学，246:1275-1271)从而使对具有PauA多肽、类似物或衍生物所需特异性的Fab片段进行快速鉴定。
用于制备单克隆抗体和抗体片段的技术在本领域众所周知，且在其它地方有另外描述，包括在Harlow和Lane，1988，抗体实验指南，冷泉港实验室；和在J.w.Goding,1986，单克隆抗体原理和实践，学术出版社，伦敦。所有上述出版物在此引用仅供参考。
反义寡核苷酸和核酶包括能够结合、降解和/或抑制PauA mRNA翻译的反义寡核苷酸的寡核苷酸、硫代磷酸及核酶也在本发明的范围之内。
反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，通过结合到靶mRNA和阻止蛋白翻译而直接阻止mRNA的翻译。例如，可通过磷酸二酯技术合成至少约15个碱基并互补于编码PauA多肽DNA序列特定区域的反义寡核苷酸。
核酶为能够催化特异性RNA切割的酶促RNA分子。核酶作用的机制包括核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，然后发生核酸内裂解。特异而有效地催化PauA mRNA序列核酸内裂解的改造的锤头状基序核酶(Engineered hammerhead motifribozyme)分子也在本发明的范围之内。
通过扫描靶分子中核酶的切割位点，包括下面的序列，GUA、GUU和GUC，可开始鉴定在任何潜在RNA靶子中的特异性核酶切割位点。一旦鉴定后，相应于含有切割位点靶基因区域的约15和20个之间的核糖核苷酸的短RNA序列可被评估用于预言结构特征如可能导致寡核苷酸序列不可适宜的二级结构。也可用，如核酸酶保护分析通过测试其与互补寡核苷酸杂交的可行性而评价侯选靶子的可适宜性。
本发明的反义寡核苷酸和核酶均可用已知的方法加以制备。这些包括用于化学合成的技术如通过固相磷酰胺化学合成。或者，反义RNA分子可通过编码该RNA分的DNA序列体外或体内的转录而产生。这种DNA序列可插入到各种载体中，其中插入有适当的RNA聚合酶启动子如T7或sp6聚合酶启动子。
可引入对本发明寡核苷酸的各种修饰作为增加细胞内稳定性和半寿期的手段。可能的修饰包括但不限于添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列至该分子的5’和/或3’末端，或硫代磷酸或2’-0-甲基而不是磷酸二酯与寡核苷酸骨架连接。
诊断试剂盒本发明进一步提供了诊断试剂盒。在无限制的实施方案中，该诊断试剂盒包括第一种容器，其中含有特异性与天然PauA蛋白抗体结合的本发明PauA蛋白、基本上同源的多肽、肽段、融合蛋白、类似物或衍生物；和第二种容器，其中包括抗-PauA-特异性抗体的二级抗体。二级抗体优选包括可检测的标记。这种诊断试剂盒用于检测目前，或以前已被产-PauA有机体如乳房链球菌感染或种痘过本发明疫苗后发生血清转换的哺乳动物。
在进一步无限制的实施方案中，本发明的诊断试剂盒包括第一种容器，其中含有特异性结合天然PauA蛋白的本发明抗体(一组抗体)；和第二种容器，其中含有特异性结合天然PauA蛋白不同表位，或特异性结合一级抗体的二级抗体。该二级抗体优选包括可检测到的标记。在进一步无限制的实施方案中，诊断试剂盒包括其中含有本发明多核苷酸分子或寡核苷酸分子的容器，这些分子用于特异性扩增病原体如乳房链球菌的编码PauA蛋白的多核苷酸分子。这后两种试剂盒用于检测目前以产-PauA有机体如乳房链球菌感染的动物。
下面的实施例仅在说明但并不意在限制本发明的范围。
实施例编码PauA DNA分子的鉴定与克隆氨基酸序列分析用国际专利公开WO 93/14209中描述的技术从乳房链球菌C216株(LatNo.053196w)中纯化PauA蛋白，即通过对无细胞培养滤液的硫酸铵沉淀，接着进行大小排阻层析，然后于16％的SDS-PAGE凝胶(Novex，圣地亚哥，加州)中分离，并电印迹至ProBlott(应用生物系统，Fosfer市，加州)用于N-末端Edman测序。将相应于PauA带(ca.35KDa)的印迹区切下并于ABI494蛋白测序仪(应用生物系统)中进行氨基酸序列分析。对于内部测序，按上述将纯化的PauA于16％的SDS-PAGE凝胶中分离并以修饰的银染(Shevchenko，等1986，分析化学，68:850-858)染色。将PauA带切下并以DTT还原凝胶薄片，以丙烯酰胺烷基化，并于50％乙腈(NH4HCO3中洗，且真空(invacuo)干燥。将凝胶薄片以50μl体积中的0.1μg修饰胰蛋白酶(Promega,Madison,WI)处理，并于37℃孵育过夜。胰蛋白酶切割的肽用下面方法提取两次，包括在通过RP-HPLC于1×250mm VydacC18柱(Nest Group公司，Southboro,MA)中分离之前于150μl 60％乙腈/NH4HCO3中超声处理。收集吸收在220nm的肽峰并在ABI 494蛋白测序仪上进行分析。获得的氨基酸序列列为SEQ ID NOS:5-12。Pep-1(SEQ ID NO:5)和Pep-2(SEQ ID NO:6)在N-末端测序后获得，而Pep-3至Pep-8(SEQ ID NOS:7-12)从纯化PauA的胰蛋白酶酶切处理而获得。
乳房链球菌染色体DNA的分离将乳房链球菌C216株和95-140株分别于100ml静置脑心灌注培养基(BHI，Difco，底特律，MI)中于37℃孵育24小时且然后收获(7,700xg,20分钟)。湿细胞沉淀于-20℃贮存待用。将湿细胞沉淀重悬于5ml Tris-Hcl(10mM)/EDTA(1mM)(TE)中洗细胞，收获(2,000xg,15分钟)，且重悬于2mlTE中。将洗过的细胞于65℃热处理20分钟，于-20℃冰冻过夜，然后通过添加250U变溶菌素(Sigma)、100mg溶菌酶(Sigma)及50μgRNAseA(Sigma)并于37℃孵育105分钟裂解。加入蛋白酶K(500μg)(Sigma)，且继续孵育3小时后加入SDS至2％(w/v)的终浓度以完全裂解。将裂解的细胞再于37℃孵育30分钟，以Tris-饱和的酚提取一次，且以酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)提取两次。通过添加2.5体积的纯乙醇和0.1体积3MNaAc,PH5.2，于-20℃孵育24小时，并离心(15,000xg,15分钟，4℃)沉淀而沉淀染色体DNA。将DNA以70％的乙醇冲洗，干燥，重悬于TE中，并通过260nm处的吸收而定量。
乳房链球菌PauA基因的部分克隆根据纯化乳房链球菌PauA的氨基酸测序设计简并寡核苷酸(图1)。设计寡核苷酸RA9(SEQ ID NO:14)从而与编码Pep-1(SEQ ID NO:5)氨基酸11-18的PauA基因部分杂交。设计寡核苷酸ER35(SEQ ID NO:15)和ER36(SEQ ID NO:16)从而与编码内部Pep-5序列(SEQ ID NO:9)氨基酸13→5的PanA基因部分杂交，且它们的简并水平不同。
对于PauA基因片段的PCR扩增，寡核苷酸RA9(SEQ ID NO:14)在50μl反应液中或者单独使用或者与ER35(SEQ ID NO:15)或ER36(SEQ ID NO:16)结合使用，反应液中含1XPC2缓冲液(Ab Peptides，公司，圣路易斯，MO),200μM每种脱氧-NTP,100pMol每种引物，7.5U Klen Taq1(Ab Peptides)和0.15U克隆的Pfu(Stratagene,La Jolla,CA)热稳定聚合酶。DNA模板为500ng乳房链球菌C216株或95-140株纯化的染色体DNA。扩增按如下进行变性(94℃5分钟)；30个循环的变性(95℃30秒)，退火(60℃1分钟)和聚合(72℃2分钟)；然后进行最后72℃7分钟的延伸。
扩增的产物通过于2％(w/v)Nusieve GTG琼脂糖凝胶(FMC生物产品，Rockland,ME)上的分离加以观察。仅用RA9(SEQ ID NO:14)与乳房链球菌C-216株的DNA作为模板的反应导致特征性640bp产物的扩增。当RA9(SEQ ID NO:4)与寡核苷酸ER35(SEQ ID NO:15)或ER36(SEQ ID NO:16)在用乳房链球菌C216或95-140株染色体DNA作为模板的PCR反应中联合使用，一般扩增出640bp和560bp的产物。该数据表明简并的寡核苷酸RA9(SEQ ID NO:14)能够在PauA区域内结合，并且其结合位置位于Pep-5(SEQ ID NO:9)的C-末端侧链、ER35(SEQ IDNO:15)和ER36(SEQ ID NO:16)的靶结合区域。
进一步分析从用乳房链球菌C216株DNA和RA9(SEQ ID NO:14)(640bp)，或RA9(SEQ ID NO:14)加ER35(SEQ ID NO:15)(640和560bp)反应得到的PCR产物。也对用引物对RA9/ER35(640和560bp)从乳房链球菌95-140株DNA扩增而得到的PCR反应产物进行分析以测定是否这些菌株的PauA区域相同。以适当的限制性核酸内切酶(KpnⅠ(RA9)或KpnⅠ加BamHⅠ(RA9/ER35))消化PCP产物后将来自乳房链球菌(C216株的640bp和560bp产物以及乳房链球菌95-140株的640bp产物分别克隆入PUC18。得到质粒的序列分析证实RA9(SEQ ID NO:14)的结合位点位于寡核苷酸ER35(SEQ ID NO:15)结合位点的3’末端(distal)(即Pep-5(SEQ ID NO:9)内部氨基酸13→5)。此外，扩增自乳房链球菌C216株和95-140株的640bp DNA片段内的360个核苷酸区域的比较表明这两种菌株的部分PauA基因之间存在着很高(99.2％)的核苷酸一致性。序列核查表明了PauAORF内限制性核酸内切酶EcoRⅠ、HindⅢ、SpeⅠ和Sall位点的存在，继而排除在构建质粒基因组文库过程中使用这些酶，设计该文库是为了获得位于独特限制性片段中的完整pauA区域。
质粒基团组文库的构建和筛选10μg乳房链球菌c216株和95-140株的染色体DNA分别以限制性核酸内切酶BglⅡ于37℃消化8小时，以酚/氯仿(24∶1)提取，并于-20℃贮存。按供应商(New England Biolabs，Beverly,MA)建议通过以BamHⅠ消化和用小牛肠磷酸酶脱磷酸化而制备1μg质粒载体DNA(pUC18)。将线性、脱磷酸化的载体(0.5μg)连接到5μg Bg(Ⅱ-消化的染色体DNA上，并按供应商(Gibco BRL,Gaithersbug MD)的建议用于转化大肠杆菌DH5α细胞(Max Efficiency)。
利用去脂奶粉平板分析以帮助检测PauA的活性。为了在大肠杆菌中文库筛选的目的，平板分析原料由补充以无脂肪干奶粉(1％w/v；OxoidTM)、牛纤溶酶原(0.015U/ml；Sigma，目录号.p-9156)和氨苄青霉素(100μg/ml；Sigma)的BHI琼脂(Difco)所组成。文库筛选也用进一步补充0.1mM IPTG以诱导乳糖pUC18启动子的这些平板进行。此平板分析通过对照平板纤溶酶原的泄漏而允许区分非特异性蛋白酶活性与纤溶酶原依赖性PauA活性。该修改用于确证脱脂奶粉纤溶酶原依赖性的消除以用于经文库筛选而获得的推断性阳性克隆。
筛选在上述脱脂奶粉平板上产生清亮区的转化大肠杆菌DH5α株的分离子用于进一步分析。图2显示了以乳房链球菌95-140株DNA转化的分离子的一个实例。筛选和克隆纯化一个含有乳房链球菌c216株DNA的分离子和一个含有乳房链球菌95-140株DNA的分离子，并通过它们的单个菌落在无纤溶酶原脱脂奶粉平板上生长后失去产生清亮区的能力而证实其表达纤溶酶原依赖性PauA活性的能力。通过每种分离子在含氨苄青霉素(100μg/ml Luria)培养基(Difco)中的培养，然后通将未过滤的培养上清等份点样至在有无0.015U/ml牛纤溶酶原存在时补充以脱脂牛奶(1％w/v)的Todd-Hewitt琼脂(Becton-Dickinson和Co.,Cockeysrille,MD)上来确证纤溶酶原的依赖性。这些分离子命名为Pz318，其表达乳房链球菌c216株的PauA；和Pz319株，其表达乳房链球菌95-140-株的PauA；它们各自的质粒命名为pER318和pER319。
pauA编码区的初步分析根据对相应于编码乳房链球菌c216株基因部分的PIR-扩增的内部640bp DNA片段的核苷酸序列分析，通过PCR确证文库筛选获得质粒中插入子的一致性。这样，pER318和pER319用作PCR中的模板，单独用源自pauA的引物RA9(SEQ ID NO:14)或者与ER37(SEQ IDNO:17)或ER40(SEQ ID NO:19)结合使用。50μl反应混合物含有1×PC2缓冲液，200μm每种dNTP，100pMol每种引物，7.5UKlenTaql聚合酶和0.15U克隆的Pfu聚合酶。合成按如下进行变性(95℃5分钟)；30轮循环变性(95℃30秒)，退火(60℃1分钟)和聚合(72℃2分钟)；然后进行最后的7分钟延伸。所有反应成功地扩增出相应于预期640bp(以RA9扩增)、500bp(以RA9/ER37)和300bp(以RA9/ER40扩增)的扩增产物，其中的DNA片段由pauA基因的已知部分序列所预言。该数据有力地表明存在于pER318和pER319中的插入子能够编码有功能活性的pauA。
将质粒pER318和pER319于St.Paul,MN的高级遗传分析中心进行自动DNA序列分析(ABI型377；应用生物系统)以更为完全地分别测定乳房链球菌c216株和95-140株pauA区域的结构。寡核苷酸ER40(SEQ ID NO:19)和ER42(SEQ ID NO:21)源自以前测定的部分pauA核苷酸序列，且用于该640bp区域外的测序。当结合640bp的部分基因序列时，此额外的测序导致全部pauA ORF以及克隆pauA基因两侧区域的初步序列测定。此外，载体特异性的M13正向和反向引物用于测定克隆的乳房链球菌DNA区域的终点(end points)。如图3所示，这些序列分析表明编码与肺炎链球菌HexA和HexB蛋白具有高度同源性的蛋白的基因存在于pER318和pER319中的克隆插入子中。从几种原核到真核种属，包括人类中，HexA和HexB蛋白与MutS和MutL同源物分别高度保守。HexA和HexB蛋白在肺炎链球菌的转化和DNA复制过程中的错配DNA修复中起作用。有趣的是，当在大肠杆菌中过份表达时，HexA赋予显著的负面表型(Prud homme等，1991细菌学杂志.173:7196-7203)，由此导致增加的自发突变率。
乳房链球菌pauA基因的特异的PCR扩增两种pauAPCR-扩增的640bp区域的初步测序结果和用质粒pER318和pER319从该区域的向外测序结果用于设计直接从乳房链球菌染色体DNA特异性扩增完整pauA基因的寡核苷酸引物。该方法优选根据需要排除由于在大肠杆菌中克隆完整的pauA过程中产生的可能突变而导致测序错误的导入。这方面就大肠杆菌中已知其它完整链激酶的毒性而言尤为重要，如别的报导(Estrada，等.，1992，生物技术.10:1138-1142)和报导的当在大肠杆菌中表达时由HexA表现出的阴性显性(negative dominamce)(突变体表型)(Prudhomme等，1991，上述)。
因此，位于完整pauA基因两侧的寡核苷酸ER4S(SEQ ID NO:24)和ER4(SEQID NO:25)用于特异性地扩增编码乳房链球菌c216株和95-140株的1.18kb的区域。对每种菌株进行三份PCR扩增。反应混合物中含有200ng纯化的染色体DNA,1×pc2缓冲液,200μm每种dNTP,100pMol引物ER45(SEQ ID NO:24),100pMol引物ER46(SEQ ID NO:25),和7.5UKlen Taq1和0.15U克隆的Pfu热稳定聚合酶于100μl终样品体积中。扩增按如下完成变性(94℃5分钟)；30轮循环的变性(95℃30秒)、退火(50℃1分钟)及聚合(72℃2分钟)；然后通过72℃7分钟的最后延伸以完成目标完整pauA基因区域的扩增。扩增后，收集三份样品中每种相等的等份(70μl,2.8μg)，并在用DyeDeoxy终止反应于ABI自动DNA测序仪(Lark技术公司，休斯顿，TX)上进行直接序列分析前通过琼脂糖凝胶电泳纯化1.8kb的产物并以玻璃奶基质(Gene CleanTM,Bi0101,.Lafolla,CA)提取。合成寡核苷酸引物APl(SEQ ID NO:13)、ER37(SEQ ID NO:17)、ER39(SEQ ID NO:18)、ER40(SEQ ID NO:19)、ER41(SEQ ID NO:20)、ER42(SEQID NO:21)、ER43(SEQ ID NO:22)、ER45(SEQ ID NO:24)和ER46(SEQ ID NO:25)(图1)用于测序从乳房链球菌C216株和95-140株扩增产物的两条DNA链。来自乳房链球菌C216株的1.18kb区域的核苷酸序列列于SEQ ID NO:1中。来自乳房链球菌95-140株的1.18kb区域的核苷酸序列列于SEQ ID NO:3中。
pauAORF的分子分析乳房链球菌C216株的pauAORF从SEQ ID NO:1的核苷酸120延伸至980，其编码列于SEQ ID NO:2中的推导的286个氨基酸的蛋白，其具有33,419道而顿的理论分子量。乳房链球菌95-140株的pauAORF从SEQ ID NO:3的核苷酸121延伸至981，其编码列于SEQID NO:4中不同的推导的286个氨基酸的蛋白。根据N-末端序列分析，两种氨基酸序列的氨基酸1-25似乎在天然pauA的成熟过程中被去除。与该观察相一致的是该25氨基酸的肽(2,767Da)为疏水性的且带正电，这正是信号序列的特征(VonHeijm,1985，分子生物学杂志.184:99-105)。推导的双向转录终止子(图4)位于相反的pauA和HexAORFs之间，在c216株序列(SEQ ID NO:1)的核苷酸978-1,088。预言形成该基茎结构基础的反向对称区域从核苷酸1,015延伸至1,032且从核苷酸1,054延伸至1,071。此外，一种几乎相同的推导的双向转录终止子位于相反的pauA和HexAORFs之间，在95-140株序列(SEQ ID NO:3)的核苷酸979-1,089。预言形成此茎环结构基础的反向对称区域从核苷酸1,016延伸至1,033且从核苷酸1,055延伸至1,072。相应的mRNA中计算的用于这些茎环结构结合(association)的自由能约19千卡(Tinoco等.,1973,Nature New Biol.246:40-41)。
序列分析表明在乳房链球菌C216株和95-140株的1.18kb片段区域内具有高度的核苷酸一致性。该区域内核苷酸和编码的氨基酸的差异总结于下表1中。
表1
a单碱基插入/缺失存在于紧邻pauA ATB起始密码子的上游。
b核苷酸变化为沉默性的或在推导的ORF内不存在。
实施例重组PauA在大肠杆菌中的表达表达质粒的构建设计寡核苷酸引物ER43(SEQ ID NO:22)和ER45(SEQ IDNO:24)(图1)以特异性地扩增编码乳房链球菌95-140株全长PauA蛋白的完整核苷酸序列。该序列也包括上面6.7部分中所述的自然推导的转录终止区，和HexA基因的小的3’部分(SEQ ID NO:3，核苷酸121-1,181)。此外，引物ER44(SEQ ID NO:23)和ER45(SEQ IDNO:24)用于特异性地扩增缺少推导编码信号序列(氨基酸1-25)的PauA基因的5’截短部分。此截短的DNA片段含有从核苷酸196延伸至1,181的普通3’区域，但预编码在大肠杆菌中表达后定位于细胞质的PauA蛋白。用200ng纯化的乳房链球菌95-140株染色体DNA在100μ1反应液中进行3份PCR扩增。样品也含有1×PC2缓冲液，200μM每种dNTP、100pMol每种引物，7.5UKlenTaql聚合酶和0.15U克隆的Pfu聚合酶。扩增条件如下变性(94℃5分钟)；30轮变性(95℃30秒)，退火(50℃1分钟)和聚合(72℃2分钟)循环；接着进行72℃7分钟的最后延伸。
以ER43(SEQ ID NO:22)加上ER45(SEQ ID NO:24)或ER44(SEQ ID NO:23)加ER45(SEQ ID NO:24)扩增后，通过合并7μl每种反应混合物以制备21μl的终体积而分别合并这三份样品。合成的DNA片段于1％(W/V)琼脂糖中分离并且纯化1,001bp(ER44/ER45)和1,073bp(ER43/ER45)的产物(jetSorbTM,GenoMed,Research Triangle Park,NC)。以KpnⅠ和XbaⅠ消化纯化的DNA后，将约0.3μg的片段连接到0.5μgKpnⅠ加上XbaⅠ限制性酶切脱磷酸化的pEA181载体DNA。通过Hanahan方法(1983，分子生物学杂志)将重组质粒转化入感受态的大肠杆菌TAP56细胞(Pfizer室内株)。细胞于30℃在1mlSOC培养基(GibcoBRL)中培养75分钟。转化子培养且维持于≤30℃以防止由于温度敏感c1857阻遏物的失活所致的PL启动子的诱导。保存用这种方式分离的两种菌株用于重组PauA的表达。菌株Pz330带有质粒pER330，由于以引物ER43/ER45的染色体DNA扩增，其表达全长pauA基因。Pz332株带有质粒pER332，由于以引物ER44/ER45的扩增，其表达截短的(信号肽去除的)pauA基因。
作为其它的实例，将源自用引物ER43/ER45或ER44/ER45对乳房链球菌95-149株染色体DNA扩增的PCR产物与以PstⅠ加上XbaⅠ消化后的PUC191acZα肽进行框内的克隆。得到的质粒，命名为pER326和pER328，分别编码全长和截短的(信号肽去除的)PauA，并导入大肠杆菌DH52以分别得到Pz326和Pz328株。
重组PauA(rPauA)的表达测试上面7.1部分中四种菌株表达全长重组PauA蛋(rPauA)(即具有信号序列)(Pz326,Pz330)，或信号序列被删除的rPauA(Pz328,Pz332)。将每种菌株过夜起始培养物培养于摇瓶中，其中具有含氨苄青霉素(100mg/L)或卡那霉素(500mg/L)的Luria培养基，然后1∶10稀释至新鲜培养基中。4-6小时的阶段后，通过添加0.5mM的IPTG(Pz326、Pz328)或通过将温度从30℃调至42℃(Pz330、Pz332)而诱导培养物。重组蛋白表达的诱导在收获细胞前2小时进行。收集全细胞沉淀，重悬于Laemmli裂解缓冲液中，且通过SDS-PAGE和Western-印迹分析裂解物。乳房链球菌95-140株的细胞沉淀在BHI培养液中培养22小时后以同样方式获得且通过Western印迹分析而用于比较。
将预诱导和诱导的全细胞沉淀样品于14％的聚丙烯酰胺凝胶中分离且或者以考马斯亮蓝染色(图5)，或以产生的抗乳房链球菌C216株天然PauA的鼠单克隆抗体EC-3进行Western印迹(图6)(详见WO93/14209关于Mab EC-3)。虽然所示的实施不是最佳表达，在42℃诱导后，用转化的大肠杆菌Pz330株和Pz332株分别获得全长和信号序列去除rPanA的显著产生。在Pz330株中检测到少量的加工过的rPauA(图6,7道)，表明乳房链球菌PauA的异源信号序列由大肠杆菌分泌器官识别和加工。然而，重组蛋白在Pz330中的表达诱导对细胞生长有害，表明全长rPauA的过度表达可干扰在异源大肠杆菌宿主中的正常输出过程。
rPauA的酶切活性用下述测定牛纤溶酶原激活的显色分析测定rPauA的活性。分析上述大肠杆菌培养物(Pz326、Pz328、Pz330、Pz332)和乳房链球菌95-140株全细胞沉淀的等份。活性与在异源宿主中表达的重组蛋白相对量一致。获得Pz332株的最大滴度(表2)。
表2
<p>a在ELISA平板中第一种稀释样品的最佳浓度b按文中所述计算的滴度显色分析如下进行。用于显色分析的缓冲试剂由TT缓冲液(0.1％Tween 80,50mM Tris-HCl,pH8.0)，和NaT缓冲液(1.77M NaCl,52mMTris-HCl,pH7.0)所组成。这些缓冲液在室温稳定且在使用前可贮存达一个月。通过在水中重新水化(rehydration)而制备尿激酶(Sigma目录号.U-8627)工作贮备液并贮存于-70℃。冷冻工作贮备液的浓度为0.51U/ml，并且用TT缓冲液1∶10稀释用于0.051U/ml的起始浓度。牛纤溶酶原(Sigma目录号P-9156)以Super Q H2O)水化至1.5U/ml并贮存于-70℃。底物包括D-ILe-Phe-LysP-硝基酰基苯胺(Sigma目录号I-6886)和D-Val-Leu-Lys P-硝基酰基苯胺(Sigma目录号V-0882；Fluka目录号94680,Fluka化学公司，Ronkonkoma，纽约)。通过在水中重新水化至1mg/ml制备这些底物的工作贮备液并贮存于-70℃。
按如下制备Immulon2分析平板(Dynatech实验室等.，chantilly,VA)。将TT缓冲液(20μl)和牛纤溶酶原(20μl)预先分装至Immulon 2平板上。在V-底(V-Bottom)平板(Dynatech实验室，公司)中，加入TT缓冲液(50μl/孔)至B-H行。将培养基对照阳性对照和样品加入A行。样品、培养基对照和阳性对照加入双重孔中。向适当的孔中或者加入100μl对照或100μl样品，然后沿着平板进行系统稀释，将最后一行丢弃50μl。将来自V-底平板每孔的10μl样品转移至含有预先分装的TT缓冲液和牛纤溶酶原的相应Immulon2平板中。将平板盖好，混合小孔并于37℃孵育2小时以允许牛纤溶酶原的激活。分析对照由尿激酶介导的牛纤溶酶原的激活所组成。
将底物(D-Val-Leu-Lys p-硝基酰基苯胺或D-Ile-Phe-Lys p-硝基酰基苯胺)温暖至室温。通过用NaT缓冲液稀释贮备底物至400μg/ml(1∶2.5稀释)而制备分析底物，且加入100μl/孔的该分析底物溶液并盖好平板且混合。然后将平板于37℃孵育2分钟。活性的PauA催化纤溶酶原至纤溶酶的转化，这反过来从p-i硝基酰基苯胺中切下三肽，这从A405处检测到。
用ELISA平板读数器(分子设备公司.,Palo Alto,CA)以Soft MaxPRO 1.2.0版软件(分子设备公司)读数平板。混合分析平板样品且在405nm测定光谱吸收。有效的测试表明A405处的阳性对照在1.30与1.50O.D之间。
为了估计滴度(排除稀释因素)(ionverse of the dilution factor),将样品稀释系列用以对数刻度的稀释度布点图(using a scetter plotgraph of the dilutions in log scale)作图。样品穿越基于阳性对照的临界值(cut-off value)的位点计为准确的滴度。为了测定断点值，使用了50％的阳性对照(0.051U/ml)平均O.D。例如，如果一样品0.007穿越临界线，那么其稀释系数将为1/142.86，且其滴度将表示为142.86。此外，如果样品在0.015处穿越临界线，则其将具有1/66.67的稀释系数且滴度将是66.67。
实施例PauA肽段的酶切和免疫学评估重组GST-PauA肽的表达设计寡核苷酸引物ER74(SEQ ID NO:26)和ER75(SEQ IDNO:27)以特异性地扩增编码包括编码PauA氨基酸27-286区域的PauA基因。此区域相应于成熟(分泌)PauA的氨基酸2-261。用250ng纯化的乳房链球菌95-140染色体DNA于每100μl反应中进行2份PCR合成。样品也含1×PC2缓冲液，200μm的每种dNTP，100pMol每种引物，7.5U KlenTaql聚合酶和0.15U克隆的Pfu聚合酶。扩增条件为变性(94℃,5分钟)；30轮变性(95℃,30秒)，退火(60℃,30秒)和聚合(72℃,1分钟)循环；接着进行72℃最后7分钟的延伸。扩增后，合并两个样品，并纯化815bp的片段(QiaQuickTM试剂盒，Qiagen,Santa Clarita,CA)以XhoⅠ和NotⅠ消化纯化的DNA后，将此片段克隆入pGE5X-2或pGEX5X-3载体DNA(Phermacia生物技术公司，Piscataway,NJ)。得到的重组质粒，pER354和pER355分别含有编码位于读框外的(out of phase)具有表达载体N-末端编码的谷胱甘肽S-转移酶(GST)的乳房链球菌95-140 PauA的氨基酸27-286的区域。
修饰质粒pER354从删除成熟PanA的COOH端区域同时也在与编码GST序列载体的融合点恢复框架。通过用XmaⅠ和Agel(消化pER354而第一次在GST-PauA融合点修复框架而构建产生成熟或成熟PauAN-末端片段(即，羧基端删除)的质粒从制备pER356。此质粒表达在翻译上融合至编码PanA氨基酸28-286的26KDaGST肽，且其产物称为成熟PauA。通过进一步以SpeⅠ、NruⅠ或HindⅢ处理此质粒然后以NotⅠ消化而产生成熟PauA的COOH-端删除。在以适于产生钝端的Klenoo片段处理后，重新连接质粒以分别产生pER363,pER364和pER365。这些质粒分别表达融合到编码PauA氨基酸28-103、28-170、和28-208的26KDa的GST肽，如表3所示。
进一步修饰质粒pER355以删除PauA的NH2-或COOH-末端区。通过以SalⅠ单独处理pER355，或以SmaⅠ加Nrul处理然后重新连接以恢复GST-PauA融合连接而产生N-末端删除。得到的质粒pER358和pER359表达分别融合到编码PauA氨基酸104-286和172-286上的GST肽。然后通过从NruⅠ或HindⅢ处理pER358接着以NotⅠ消化、Klenow处理且重新连接而制备代表内部PauA肽段的两种质粒。这些重组质粒，pER366和pER367表达分别融合到编码PauA氨基酸104-170和104-208上的GST肽。最后，通过从HindⅢ加上NotⅠ消化pER359，接着以Klenow处理且重新连接产生能够表达融合至小PauA片(编码PauA的氨基酸172-208)上GST的质粒。此质粒命名为pER368。该编码的片段和表达为与GST融合蛋白的PauA-特异性肽估计分子量小结于表3。
表3
a菌株命名除在质粒数之前Pz代替pER外与质粒相同。
b氨基酸数目相应于显示于SEQ ID NO:4中编码PauA蛋白的氨基酸数目。
c列出融合蛋白PauA部分的分子量，GST约-26KDa。
除了由pER36编码的外，所有的GST-PauA融合蛋白约在大肠杆菌内表达并按制造商建议(pharmacia)通过亲和层析纯化。由于由pER363编码蛋白的表达导致在大肠杆菌中包涵体的形成，在以溶菌酶细胞裂解后纯化这些蛋白的团聚物(aggregates)。添加10体积2×RIPA/TET(5∶4v/v)前将细胞于冰中孵育10分钟。2×RIPA含有20mM Tris(PH7.4)、0.3M NaCl,2％脱氧胆酸钠、和2％(V/V)Igepal CA-630。TET缓冲液含0.1M Tris(PH8.0)、50mM EDTA，和2％(V/V)TritonX-100。将悬浮的细胞混合物旋转且于冰上孵育5分钟。然后处理至悬液不再粘滞。离心(15,000kg,20分钟)收获包涵体，重悬于H2O中且贮存于-80℃。
通过蛋白水解切割制备PanA片段将约13ml 0.55mg/ml从乳房链球菌95-140株纯化的天然PauA(LotNo.9700710A)于4℃在PH8.8的50mM Tris中透析。用YM10膜将存留物浓缩至-2.5ml且搅拌细胞。最终的蛋白浓度为2.64mg/ml。将该浓缩物以120U凝血酶(Bochringer Ingelheim)室温处理3天，且将消化产物于-20℃冷冻。用Superdex 75柱(16/50)(Pharmacia)从2ml消化产物中完成对其中-16KDa片段的纯化。根据SDS-PAGE分析收集和合并适当的馏份。最终蛋白浓度为2.5ml中的0.165mg/ml。N-末端测序表明该16KDa肽代表PauA的羧基端一半部分。获得的序列(KRVEEPITHP)(SEQ ID NO:28)在乳房链球菌95-140株编码PauA的赖氨酸149开始。因此，此获得自蛋白水解的肽称为PauA149-286。
PauA肽段的酶切活性将9种表3中描述的GST-PauA融合蛋白和上面8.2中描述的蛋白酶PauA片段(PauA149-286)与天然PauA用基本上在上面7.3部分中所述的显色分析进行酶活性的比较。纯化GST-PauA28-286融合蛋白的酶活性(滴度=3448)与天然PauA的酶活性(滴度=3256)类似，而剩下的PauA肽段缺乏酶活性。通过存在于纯化蛋白制品中PauA特异性蛋白的量来划分滴度(dividing the titer)计算PauA特异活性。当进行该校正时，天然PauA特异性活性为5.9显色单位/μg且GST-PauA28-286的特异性活性为1.4。此数据表明重组生产的GST-PauA较纯化的天然PauA活性相对较低，但其的确显示出显著的酶活性。
小鼠中免疫反应的特征描述以PauA肽段免疫小鼠用于种痘的鼠模型用于评价按上述制备的PauA肽段的免疫原性。简言之，且10只雌性Balb/c小鼠(16-18g)组成的实验组于0.21和42天免疫。于实验的0.21、35和56天并获取血液样品。合并实验组这些样品的血清并进行如下分析，包括与固相天然纯化PauA的ELISA反应性及天然PauA显色活性的血清中和效应。
天然PauA和各种肽段的配制是位于水中(角)鲨烯乳剂运载体中，后者含有Quil A(Superfos)作为免疫刺激剂，其含量为对小鼠无毒性的水平。蛋白以100μl剂量中3-5μl进行配制并皮下施用。对照无-抗原疫苗由Dulbecco's PBS(DPBS；Gibco-BRL)所组成，其中含有载体/免疫刺激剂而无抗原成分。
PauA肽段的免疫原性对获自上面免疫研究的各种鼠血清进行分析以测定是否产生PauA-特异性抗体，和测定产生抗体的性质。以蛋白酶PauA片段(PauA149-286)和每种GST-PauA融合蛋白免疫后用PauA-特异性Ig ELISA以测定血清的特异性。将100μl纯化天然PauA(在国际专利公开WO93/14209中描述，且那里命名为“链激酶”)(PBS中1.8mg/ml)加入ImmulonⅡ平板(Dynatech)上的每孔中并于4℃孵育过夜。将平板内含物倾空(decanted)并将平板吸干(blotled dry)。通过向每孔中加入PBS中(1％PVA/PBS)的250μl 1％聚(乙烯醇)(87-89％水解；Aldrich化学公司.,Milwaukee,WI)而封闭平板，并于37℃孵育1小时。再次将平板倾空并吸干。
将实验血清于1％PVA/PBS中以1∶100稀释，然后在样品孔中置100μl进行3倍系列稀释。阳性对照为PauA-特异性单克隆抗体，EC-3，其中的抗体用固定的蛋白G亲和纯化过。将此单克隆抗体于1％PVA/PBS中稀释至2μg/ml，然后将100μl加入到适当的孔中。阴性对照由在1％PVA/PBS中以1∶100稀释的合并预先种痘小鼠血清所组成。
加入实验和对照样品后，将平板轻轻以混合，然后置于37℃1小时。样品孔以0.05％Tween 20/PBS用自动微板洗板机(EL403型；Bro-TEK仪器公司，Winooski,VT)洗5次。通过添加100μl在1％PVA/PBS中1∶10,000稀释的交联单抗鼠Ig(H孔L，链，1.0mg/ml,Kirkegaard和Perry实验室，Gaithersburg,MD)检测结合的抗体。轻轻敲打平板以混合，于37℃置1小时，并按前述洗板。在室温显色15分钟之前加入100μlABTS(Kirkegaard&amp;Perry)至平板。用Thermo Max平板读数器(分子设备公司)和SoftMaxPro1.2版程序(分子设备公司)于405-490nm处对平板进行读数。去除阳性对照OD405-490 50％稀释因素计算IgGELISA滴度。
如表4中所示，以每种这9种GST-PauA融合蛋白对小鼠的免疫导致产生PauA-特异性的免疫球蛋白G。以GST-PauA28-286、GST-PauA104-286、或GST-PauA28-170的免疫诱导与天然PauA诱导相当或较之更大的IgGELISA。与重组PauA肽段相比蛋白酶来源的肽、PauA149-286产生相对低的滴度。第三次免疫后，该肽段诱导相当于其最类似校正肽(comparator pepfide)，即GST-PauA172-286约1/10的PauA-特异性滴度。虽然该特定的肽(PauA149-286)诱导低的IgG反应，但预期天然PauA的其它片段将能够诱导与重组肽显示的相当的免疫反应。
血清中和活性将来自上面免疫的血清进一步分析以检测它们是否含有能够阻止由PauA所致牛纤溶酶原至纤溶酶转换的抗体。通过在含10％胎牛血清的TEA缓冲液中(TEA/FBS；Novatech公司，Grand Island,NE)对血清样品进行1∶50的稀释而完成血清中和反应分析。1升TEA缓冲液由3.34g Tris碱、3.54g Tris HCl,5.8g NaCl,1.1g EDTA(水合四钠)、42.2g(L)-盐酸精氨酸和1.0mlTween80所组成。将缓冲液PH调至8.0，然后于室温中贮存备用。中和分析使用前将FBS加入到TEA缓冲液中。然后在V-底平板(Dynatech)中以TEA/FBS将TEA/FBS中的血清样品进行两倍的系列稀释。然后将25μl的测试样品转移至ImmulonⅡ平板(Dynafech)。将从乳房链球菌分离的纯化天然PauA(lotNo.9700710A)用TEA缓冲液稀释至76μg/ml，然后将25μl加入到含有预先分装有血清的每孔中。将平板缓慢敲打以混匀并于37℃放置1小时。阳性对照为血清阳性中的冻干IgG部分。将此IgG部分重新水合至3.8mg/ml，于TEA/FBS中进行1∶50稀释，且转移至ImmulonⅡ平板。将25μl阳性对照和25μl于TEA/FBS中1∶50稀释的FBS分装至适当的孔中。
通过添加底物检测PauA活性的中和反应。通过以2∶3∶1的比例混合纤溶酶原(1U/ml；P-9156，Sigma)、chomozym(1mg/ml；宝灵曼，Indianapolis,IN)，和TEA缓冲液制备底物，将150μl该底物加入每个样品孔，轻轻敲打平板以混合且然后于37℃孵育90分钟。用Thermo Max平板读数器和Soft Max PRO1.2版计算机程序于405/490nm处对平板读数。以相当于50％阴性对照稀释度的倒数计算滴度。
中和反应分析表明几种肽段均能够诱导针对天然PauA的中和反应。以重组蛋白GST-PauA28-286、GST-PauA104-286、GST-PauA28-170、或GST-PauA28-208注射小鼠后获得的血清与以天然PauA注射小鼠而获得的血清显示出类似的中和滴度。因此，当注射至小鼠时，这些肽段诱导能够干扰纯化天然PauA酶活性的抗体的产生。
表4
a数据根据三个不同的研究总结出来且根据研究分组。
两种对照包括在每个实验中且列于表底部。
上面引用的所有的专利、专利申请及公开在此引用以其全文作为参考。
本发明范围不受所述具体实施方案限制，这些方案试图单独说明本发明的单个方面。功能上相当的组合物和方法也在本发明的范围当中。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人ROSEY,EVERETTL.
YANCEY Jr.,ROBERT J.
LEIGH,JAMES A.(ⅱ)发明题目编码纤溶酶原激活蛋白的DNA(ⅲ)序列数目28(ⅳ)通讯地址(A)地址PFIZER INC(B)街道第42街道东235(C)城市纽约(D)州纽约(E)国家美国(F)邮编10017(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release＃1.0,1.25版(ⅵ)当前申请数据(A)申请号待指定(B)提交日期(C)分类(ⅷ)律师/代理信息(A)姓名KOLLER,,ALAN L.
(B)注册号37,371(C)参考/证书号PC9836(ⅸ)通讯信息(A)电话212-573-2118
(B)传真212-309-4801(2)SEQID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)长度1180碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特征(A)名字/关键CDS(B)位置120..980(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NOL:1:GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA 60TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTT 119ATG AAA AAA TGG TTT TTA ATA TTA ATG CTT TTG GGA ATA TTT GGT TGT 167Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 215Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 263Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45ATA AAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 311Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA GAT CAA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 359Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asp Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 407Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 455Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110TTA ACA CAA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC AAT CAA AAT TTT GAG GAA503Leu Thr Gln Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gln Asn Phe Glu Glu115 120 125TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT551Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140GTT ATT CTC AGA AAA CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG599Val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145 150 155 160ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT AAA GAT GGG GAA647Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA695Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG TTT CGA AAA ATT GCA GAA GAA AAG CTT743Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205TTG CAA CTC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA AAA GAA TAT ACT ATC791Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA TAT TAT TCT TAT CAA839Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gln225 230 235 240GAT CAT TTC AGC TAC GAA ATT CAA GAT AGG CAA CGT ATC ATG GCT AAG887Asp His Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255GAC CCA AAA TCC GGA AAA GAA CTC GGT GAA ACT CAA AGT ATT GAT AAT935Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC AAA AAA AGT TAT AAA CCT TAAAGGAAGT 987Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280 285ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGACGGCC 1047TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA TTTTTTTCTT TAGATCAAAC AAAACAGTCA 1107TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1167GAGAGGAATC TCA1180(2)SEQID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度286个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asp Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110Leu Thr Gln Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Gln Asn Phe Glu Glu115 120 125Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140Val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145 150 155 160Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Gln225 230 235240Asp His Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280285(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度1181个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)特性(A)名字/关键CDS(B)位置121..981(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:3:GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATATCTACTT CAATTTGTTC TAAAATGAAA60TTATATTCAC TGCTGTTACA TAACTTTGTG ATTATTTAGG ATAAAATAAG GGAGATTTTT 120ATG AAA AAA TGG TTT TTA ATA TTA ATG CTT TTG GGA ATA TTT GGT TGT 168Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15GCT ACT CAA CCA TCA AAG GTT GCA GCA ATA ACC GGT TAT GAT TCC GAC 216Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30TAC TAC GCT AGA TAT ATT GAT CCC GAT GAA AAT AAA ATA ACA TTT GCC 264Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45ATA AAT GTT GAT GGT TTT GTC GAA GGT AGT AAT CAA GAA ATC CTT ATT 312Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60AGA GGA ATT CAT CAT GTT TTA ACA AAT CAA AAC CAA AAG ATT GTT ACA 360Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asn Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80AAG GCC GAG TTG TTA GAC GCT ATT AGA CAT CAA ATG GTT CTT CTA CAA 408Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95TTG GAT TAT TCC TAT GAA CTA GTC GAC TTT GCG CCT GAT GCA CAA TTA 456Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110TTA ACA CGA GAT CGA CGG CTT TTA TTT GCC AAT CGA AAT TTT GAG GAA504Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu Glu115 120 125TCC GTA TCA CTT GAA GAT ACT ATT CAA GAA TAC CTT TTA AAA GGG CAT552Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140GTT ATT CTC AGA AAA CGG GTT GAA GAA CCT ATC ACT CAT CCT ACT GAG600Val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145 150 155 160ACT GCT AAT ATT GAG TAT AAA GTT CAA TTC GCG ACT AAA GAT GGG GAA648Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175TTC CAC CCA CTA CCT ATT TTT GTA GAC TAC GGA GAA AAA CAT ATT GGA696Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190GAA AAA TTA ACC TCT GAC GAG TTT CGA AAA ATT GCA GAA GAA AAG CTT744Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205TTG CAA CGC TAC CCT GAC TAT ATG ATT GAT CAA AAA GAA TAT ACT ATC792Leu Gln Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220ATT AAA CAC AAT TCT CTT GGT CAA CTT CCA AGA TAT TAT TCT TAT CCA840Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Pro225 230 235 240GAT GAT TTC AGC TAC GAA ATT CAA GAT AGG CAA CGT ATC ATG GCT AAG888Asp Asp Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255GAC CCA AAG TCC GGA AAA GAA CTC GGT GAA ACT CAA AGT ATT GAT AAT936Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270GTT TTT GAG AAA TAC CTT ATT ACC AAA AAA AGT TAT AAA CCT TAAATGAAGT 988Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280 285ATCCATTAAA TTTTTCTGCA TCACTAAAAA AACACGAGCA TCACTTTCAA AGGGAAGGCC 1048TTCGTTAGTA ACGCTAGTGT TTTTATTTTA TTTTTTTCTT TAAATCAAAC AAAACAGTCA 1108TAGCTTCCAT TGGAGTCATA TTCATGACAT CTACTTCTTT AAGTCTATTA ATGATATCTA 1168GAGAGGAATC TCA1181(2)SEQID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)长度286个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Lys Lys Trp Phe Leu Ile Leu Met Leu Leu Gly Ile Phe Gly Cys1 5 10 15Ala Thr Gln Pro Ser Lys Val Ala Ala Ile Thr Gly Tyr Asp Ser Asp20 25 30Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala35 40 45Ile Asn Val Asp Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile50 55 60Arg Gly Ile His His Val Leu Thr Asn Gln Asn Gln Lys Ile Val Thr65 70 75 80Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg His Gln Met Val Leu Leu Gln85 90 95Leu Asp Tyr Ser Tyr Glu Leu Val Asp Phe Ala Pro Asp Ala Gln Leu100 105 110Leu Thr Arg Asp Arg Arg Leu Leu Phe Ala Asn Arg Asn Phe Glu Glu115 120 125Ser Val Ser Leu Glu Asp Thr Ile Gln Glu Tyr Leu Leu Lys Gly His130 135 140val Ile Leu Arg Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro Thr Glu145150 155 160Thr Ala Asn Ile Glu Tyr Lys Val Gln Phe Ala Thr Lys Asp Gly Glu165 170 175Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Asp Tyr Gly Glu Lys His Ile Gly180 185 190Glu Lys Leu Thr Ser Asp Glu Phe Arg Lys Ile Ala Glu Glu Lys Leu195 200 205Leu Gln Arg Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr Ile210 215 220Ile Lys His Asn Ser Leu Gly Gln Leu Pro Arg Tyr Tyr Ser Tyr Pro225 230 235 240Asp Asp Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg Gln Arg Ile Met Ala Lys245 250 255Asp Pro Lys Ser Gly Lys Glu Leu Gly Glu Thr Gln Ser Ile Asp Asn260 265 270Val Phe Glu Lys Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Ser Tyr Lys Pro275 280 285(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名字/关键肽(B)位置1..18(D)其它信息/标记=Xaa/注“Xaa=Pro或Gly”(ⅹⅰ)序列言息SEQ ID NO:5:Ile Thr Xaa Tyr Asp Ser Asp Tyr Tyr Ala Arg Tyr Ile Asp Pro Asp1 5 10 15Glu Asn(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Tyr Ile Asp Pro Asp Glu Asn Lys Ile Thr Phe Ala Ile Asn Val Asp1 5 10 15Gly Phe Val Glu Gly Ser Asn Gln Glu Ile Leu Ile Arg Gly Ile20 25 30(ⅰ)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Ile Val Thr Lys Ala Glu Leu Leu Asp Ala Ile Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:8信息(ⅰ)序列特征(A)长度16个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅸ)特征(A)名字/关键肽(B)位置1..16(D)其它信息/标记=Xaa/注=“Xaa=未知”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Asp Gly Glu Phe His Pro Leu Pro Ile Phe Val Xaa Tyr Xaa Glu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:9信息(ⅰ)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Leu Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:10信息(ⅰ)序列特征(A)长度19个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Leu Leu Gln Leu Tyr Pro Asp Tyr Met Ile Asp Gln Lys Glu Tyr Thr1 5 10 15Ile Ile Lys(2)SEQ ID NO:11信息(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Tyr Tyr Ser Tyr Gln Asp His Phe Ser Tyr Glu Ile Gln Asp Arg1 5 10 15(2)SEQ ID NO:12信息(ⅰ)序列特征(A)长度5个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅴ)片段类型内部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Tyr Leu Ile Thr Lys1 5(2)SEQ ID NO:13信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:13:ATCATATAGT CAGGGTAGAG(2)SEQ ID NO:14信息(ⅰ)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:CGGGTACCGW TATATTGATC CWGATGARAA(2)SEQ ID NO:15信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:15:GGGGATCCTT TTGATCAATW GGATAATCWG GATA(2)SEQ ID NO:16信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GGGGATCCTT YTGRTCRATW GGRTARTCWG GRTA(2)SEQ ID NO:17信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:GTTACAAAGG CCGAGTTGTT AGAC(2)SEQ ID NO:18信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:GATTGGCAAA TAAAAGCCGT CGATC(2)SEQ ID NO:19信息(ⅰ)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CTTCAAGTGA TACGGATTCC TC(2)SEQ ID NO:20信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:GGGGAATTCC ACCCACTACC(2)SEQ ID NO:21信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:GACGAGTTTC GAAAAATTGC AGAAG(2)SEQ ID NO:22信息(ⅰ)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:GGGCTGCAGT CATATGAAAA AATGGTTTTT AATATTAATG CTTTTGGG(2)SEQ ID NO:33信息(ⅰ)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:GGGCTGCAGT CATATGATAA CCGGTTATGA TTCCGACTAC TACG(2)SEQ ID NO:24信息(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:GAGATTCCTC TCTAGATATC A(2)SEQ ID NO:25信息(ⅰ)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:GGGCTGCAGA TCCGTTAAAA AATGACATTA ATAT(2)SEQ ID NO:26信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假定的无(ⅳ)反义无(ⅵ)最初来源(A)有机体乳房链球菌(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:GCGGCTCGAG ACCGGTTATG ATTCCGACTA C(2)SEQ ID NO:27信息(ⅰ)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假定的无(ⅳ)反义无(ⅴⅰ)最初来源(A)有机体乳房链球菌(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:GTTGCGGCCG CGGATACTTC ATTTAAGGTT TAT(2)SEQ ID NO:28信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组)(ⅲ)假定的无(ⅳ)反义无(ⅴ)片段类型内部(ⅴⅰ)最初来源(A)有机体乳房链球菌(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:Lys Arg Val Glu Glu Pro Ile Thr His Pro1 5 10
权利要求
1．一种分离的多核苷酸分子，包括编码乳房链球菌PauA蛋白的核苷酸序列。
2．权利要求1的分离的多核苷酸分子，其中的PauA蛋白包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4约氨基酸位置26至约氨基酸位置286的氨基酸序列。
3．权利要求2的分离的多核苷酸分子，分别包括SEQ ID NO:1约核苷酸位置195至约核苷酸位置977，或SEQ ID NO:3约核苷酸位置196至约核苷酸位置978的核苷酸序列。
4．权利要求2的分离多核苷酸分子，其中的PauA蛋白包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
5．权利要求4的分离多核苷酸分子，分别包括SEQ ID NO:1约核苷酸位置120至约核苷酸位置980，或SEQ ID NO:3约核苷酸位置121至约核苷酸位置981的核苷酸序列。
6．权利要求5的分离多核苷酸分子，分别包括SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
7．基本上同源于权利要求3多核苷酸分子的分离多核苷酸分子。
8．一种分离的多核苷酸分子，包括编码基本上同源于包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4中从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白的多肽的核苷酸序列。
9．一种分离的多核苷酸分子，由下面的核苷酸序列所组成，其编码SEQ ID NO:2氨基酸序列的肽段或其基本上同源的多肽，或SEQ IDNO:4的氨基酸序列的肽段或其基本上同源的多肽。
10．权利要求9分离的多核苷酸分子，其中的肽段由选自下面区段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸子序列所组成，即氨基酸位置28至约286、约104至286、约172至约286、约28至约170、约104至约170、约104至约208、约172至约208、约28至约103、约28至约208，及约149至约286的子序列。
11．包括编码融合蛋白核苷酸序列的分离多核苷酸分子，所述的融合蛋白包括:(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286的氨基酸序列的PauA蛋白；(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)PauA蛋白的肽段或基本上同源的多肽，融合到融合配偶体上。
12．权利要求11的分离多核苷酸分子，其中的融合蛋白选自β-半乳糖苷酶融合体、trpE融合体、麦芽糖结合蛋白融合体，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合体，和多组氨酸融合体。
13．权利要求11的分离多核苷酸分子，其中的从SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4约氨基酸位置26至约氨基酸位置286的PauA蛋白氨基酸序列分别由SEQ ID NO:1的约核苷酸位置195至约核苷酸位置977的核苷酸序列，或从SEQ ID NO:3的约核苷酸位置196至约核苷酸位置978的核苷酸序列所编码。
14．权利要求11的分离多核苷酸分子，其中的肽段由选自下面区段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸子序列所组成，即从约28至286、约104至约286、约172至约286、约28至约170、约104至约170、约104至约208、约172至约208、约28至约103、约28至208、及约149至约286的氨基酸子序列所组成。
15．权利要求14的分离多核苷酸分子，其中的融合配偶体是GST。
16．在中等或高度严格的条件下与由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3核苷酸序列所组成的多核苷酸分子，或与由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3核苷酸序列互补的核苷酸序列所组成的多核苷酸分子杂交的寡核苷酸分子。
17．权利要求16的寡核苷酸分子，由选自SEQ ID NO:13-27的核苷酸序列及其互补核苷酸序列所组成。
18．权利要求16的寡核苷酸分子，包括选自SEQ ID NO:13-27的核苷酸序列及其互补的核苷酸序列。
19．一种重组表达载体，包括含有编码下面物质的核苷酸序列的多核苷酸分子(a)包括SEQID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)PauA蛋白的肽片段或基本上同源的多肽；或(d)包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽、或肽段的融合蛋白，其中的多核苷酸分子与宿主细胞中控制该多核苷酸分子表达的一个或更多个调节元件可操作地连接。
20．权利要求19的重组表达载体，其中的从SEQ ID NO:2或SEQID NO:4约氨基酸位置26至约氨基酸位置286的PauA蛋白的氨基酸序列分别由包括SEQ ID NO:1的约从核苷酸位置195至约核苷酸位置977，或SEQ ID NO:3的约从核苷酸位置196至约核苷酸位置978的核苷酸序列的多核苷酸分子所编码。
21．权利要求19的重组表达载体，其中的PauA蛋白的肽段由选自下面区段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸子序列所组成，即氨基酸位置约28至约286、约104至约286、约172至约286、约28至约170、约104至约170、约104至约208、约172至约208、约28至约103、约28至约208、及约149至约286的氨基酸子序列。
22．权利要求19的重组表达载体，其中的融合配偶体为GST。
23．权利要求19的重组表达载体，进一步包括可选择标记。
24．以权利要求19的重组表达载体转化的宿主细胞。
25．一种分离的多肽:(a)其为包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)其基本上同源于PauA蛋白；或(c)其为由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽子序列所组成的肽段；或(d)其为包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白。
26．权利要求25的多肽，其中的PauA蛋白包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置1至约氨基酸位置286的氨基酸序列。
27．权利要求25的多肽，其中的PauA蛋白肽段由选自下面区段的SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4氨基酸子序列所组成，即氨基酸位置约28至约286、约104至约286、约172至约286、约28至约170、约104至约170、约104至约208、约172至约208、约28至约103、约28至约208、及约149至约286的氨基酸子序列所组成。
28．权利要求25的多肽，其中的融合蛋白包括由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4选自下面区段的氨基酸子序列所组成的PauA蛋白肽段，即由氨基酸位置约28至约286、约104至约286、约172至约286、约28至约170、约104至约170、约104至约208、约172至约208、约28至约103、约28至约208、及约149至约286的氨基酸子序列所组成的PauA蛋白肽段。
29．权利要求28的多肽，其中的融合配偶体为GST。
30．用于制备多肽的方法，包括在易于产生表达载体编码的多肽的条件下培养以权利要求19的重组表达载体转化的宿主细胞，和从细胞培养物中回收该多肽。
31．多肽的类似物或衍生物，其中的多肽(a)为包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO4的从约氨基酸位置26至约氨酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白；或(c)为由PauA蛋白子序列或基本上同源的多肽所组成的肽段；或(d)为包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源的多肽或肽段的融合蛋白。
32．用于保护哺乳动物种类成员抵抗乳腺炎的疫苗，包括免疫学有效量的(a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白或基本上同源多肽的子序列所组成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白的类似物或衍生物；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应；和兽医上可接受的载体。
33．权利要求32的疫苗，进一步包括佐剂。
34．权利要求32的疫苗，其包括含有多核苷酸分子的转化宿主细胞，其中的多核苷酸分子包括编码能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物的核苷酸序列，其中的多核苷酸分子在宿主细胞中表达以产生PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物。
35．权利要求34的疫苗，其中的宿主细胞为大肠杆菌。
36．用于保护哺乳动物种类成员抗乳腺炎和任选一种或多种其它能够折磨哺乳动物的疾病或病理症状的组合疫苗，其中的组合疫苗包括免疫学有效量的第一种成分，其包括a)含有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列所组成的肽段或基本上同源的多肽；或(d)包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的类似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、或类似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应；包括能够诱导抗能够折磨哺乳动物的疾病或病理症状的保护性反应抗原的免疫学有效量的第二种成分；和兽医上可接受的载体。
37．权利要求36的组合疫苗，其中的组合疫苗的第二种成分的抗原能够在哺乳动物中诱导抗疾病，症状(condition)或选自下面病原体的保护性反应，包括乳腺炎、牛疱疹病毒、牛呼吸道合胞病毒，牛病毒性腹泻病毒、Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型副流感病毒、钩端螺旋体属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、枝原体属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、轮状病毒、冠形病毒、狂犬病、巴斯德氏菌属、梭菌属、破伤风类毒素、大肠杆菌、或Neospora spp。
38．权利要求36的组合疫苗，进一步包括佐剂。
39．权利要求36的组合疫苗，包括用作与乳房链球菌导致的乳腺炎以外的疾病或病理症状有关的病原体的宿主细胞，其中的疾病或病理症状可折磨哺乳动物，其中的宿主细胞包括含有编码能在哺乳动物中诱导抗乳腺炎保护性反应的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的多核苷酸分子在宿主细胞中表达以产生PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物，且其中的宿主细胞能够诱导抗除由乳房链球菌导致的乳腺炎以外的疾病或病理症状的保护性免疫反应。
40.权利要求39的组合疫苗，其中的宿主细胞选自钩端螺旋体属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、枝原体属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、巴斯德氏菌属、梭菌属、大肠杆菌和Neospora spp。
41.制备用于保护哺乳动物种类成员抗乳腺炎的疫苗的方法，包括组合免疫有效量的a)包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽所组成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的类似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应，与兽医上可接受的载体。
42.种痘哺乳动物种类成员抗乳腺炎的方法，包括施用权利要求32的疫苗至哺乳动物。
43.用于种痘哺乳动物种类成员抗乳腺炎的试剂盒，包括含有免疫有效量下面物质的第一种容器a)包括SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽所组成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的类似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；或(f)包括编码PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或类似物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其中的蛋白、多肽、肽段、融合蛋白、类似物、衍生物或多核苷酸分子能够在哺乳动物中诱导抗乳腺炎的保护性反应；和含有兽医上可接受的载体或稀释剂的第二种容器。
44.特异性结合下面物质的抗体a)包括SEQ ID NO:2或SEQID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；或(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白的子序列或基本上同源多肽所组成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的类似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白。
45.诊断试剂盒，包括含有下面物质的第一种容器a)包括SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列的PauA蛋白；(b)基本上同源于PauA蛋白的多肽；或(c)由PauA蛋白子序列或基本上同源多肽所组成的肽段；或(d)包括融合到融合配偶体上的PauA蛋白、基本上同源多肽或肽段的融合蛋白；或(e)PauA蛋白的类似物或衍生物、基本上同源多肽、肽段或融合蛋白；其中的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段、融合蛋白、类似物或衍生物特异性地结合抗天然PauA蛋白的抗体；和包括针对抗-PauA蛋白特异性抗体的二级抗体的第二种容器。
46.权利要求45的诊断试剂盒，其中的二级抗体进一步包括可检测的标记。
47.诊断试剂盒，包括含有特异性结合含有SEQ ID NO:2或SEQID NO:4从约氨基酸位置26至约氨基酸位置286氨基酸序列PauA蛋白的一级抗体的第一种容器，和含有特异性结合PauA蛋白上不同表位或特异性结合一级抗体的二级抗体的第二种容器。
48.权利要求47的诊断试剂盒，其中的二级抗体进一步包括可检测的标记。
49.诊断试剂盒，包括含有对特异性扩增编码乳房链球菌编码PauA蛋白多核苷酸分子有用的多核苷酸分子或寡核苷酸分子的容器。
全文摘要
本发明提供了包括编码乳房链球菌纤溶酶原激活(PauA)蛋白、和其基本上同源的多肽、肽段及融合蛋白核苷酸序列的多核苷酸分子。本发明进一步提供了用于重组表达由本发明多核苷酸分子编码的PauA蛋白、基本上同源多肽、肽段及融合蛋白的组合物和方法。本发明进一步提供了用于保护哺乳动物种类成员抗乳腺炎的疫苗,包括本发明PauA蛋白,基本上同源多肽、肽段、融合蛋白或多核苷酸分子。
文档编号C07K19/00GK1209455SQ9810333
公开日1999年3月3日 申请日期1998年6月22日 优先权日1997年6月23日
发明者E·L·罗斯, R·J·杨西, J·A·雷格 申请人:辉瑞大药厂