专利名称：具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种基因重组方法制备具有抗纤溶酶活性的多肽textilinin-Ι。其关键是textilinin-1 (Q8008)基因的密码子优化、合成、克隆、表达及产物的发酵表达和分离纯化制备。重组textilinin-Ι可以作为止血药，用于控制手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。
背景技术：
临床上，外科手术中如何減少血液的流失是需要密切关注的重要事件，尤其是对手术时间较长的心肺旁路手术，就更应该采取一定的措施，避免和減少患者的大量出血。減少外 科手术中血液的用量能有效地降低因输血产生的大量问题和避免经血液传播疾病的感染，如こ型肝炎病毒，人免疫缺陷型病毒(HIV)和变型的克罗伊茨费尔特-雅各布病等。止血药aprotinin (抑酞酶)在国外被常用于心脏外科手术中，主要用于体外循环下实施冠状动脉旁路移植术(CABG)的病人，以减少手术过程中的出血，并相应降低输血需求。但aprotinin有明显的副作用，可产生严重的不良反应，主要包括过敏性休克、心肌缺血、血栓形成、心カ衰竭、肾功能异常、急性肾衰竭等，目前已经停止使用。目前在国内还没有发现有同类产品的研究和报告。澳大利亚研究的textilinin-1仍处于实验室研究阶段。初步试验结果证明textilinin-l与aprotinin相比,在相同用量的情况下，其止血过程更安全可靠。textilinin-1 (Txln-1),是一种Kunitz-型蛋白酶抑制剂，是从澳大利亚棕蛇Pseudonaja textilis textilis中提取的,具有59个氨基酸,分子量为6. 7 kDa的多肽。这个分子被建议作为在外科手术中aprotinin的替代药物。虽然textilinin-Ι与aprotinin在蛋白序列上相似度只有47%。但在这两种多肽中，六对ニ硫键是高度保守的。因此，预期他们的分子空间折叠是相似的，只是分子表面特性有些不同。textilinin-Ι 和 aprotinin 都具有强烈地抑制 plasmin、elastase 和 trysin 活性的作用。石开究发现 aprotinin 对 urokinase, thrombin 和 kallikrein t匕 textilinin—l强。被textilinin-Ι抑制的plasmin将很快地被逆转，并比aprotinin易于控制,这可有助于控制血浆和损伤部位的抗纤维蛋白溶解活性。textilinin-Ι的这ー特点降低了由于強烈抑制纤溶酶(aprotinin)而导致的血栓风险，使它成为減少手术中血液损失的安全治疗性药物。并且，由于textilinin-Ι相对于plasmin有更强的专一'丨生，可以在较高的剂量使用而没有由于酶特异性差而导致的安全风险。与主要用于心脏外科手术中aprotinin相比，Textilinin-I可能作为更可靠和更安全的止血用药。textilinin-Ι可引起预期的血块溶解抑制作用。在同样的摩尔浓度下，aprotinin的抑制作用显著低于textilinin-Ι。这也是早期用血衆凝块溶解实验所证明的。textilinin-Ι可抑制纤溶酶活性，并在小动物模型中能减少出血。textilinin-Ι同aprotinin ー样,在5微摩的浓度下就能产生几乎完全抑制tPA诱导产生的全血凝块纤维蛋白的溶解。aprotinin能显著增加血衆aPTT,而血衆aPTT则不受textilinin-Ι的影响。在小鼠尾静脉出血动物模型中，静脉给药，textilinin-Ι和aprotinin都能起到相同的减少血液损失的作用。但textilinin-Ι可使小鼠止血时间更短。说明textilinin-Ι值得进ー步研究，有望开发成为替代aprotinin的药物。蛇毒中提取的Textilinin-Ι为59个氨基酸的多肽，含有三对分子内ニ硫键，其天然核酸和氨基酸序列如下I MG GAC CGT CCG GAT TTC TGT GM CTG CCT GCT GAC ACCGGA CCA 45 I KDR P DF CEL PA DTGP 15 46 TGT AGA GTC AGA TTC CCA TCC TTC TAC TAC AAC CCA GAT GAA AM 9016 CRV RF PS FYY NP DEK 30 91AAG TGC CTA GAG TTT ATT TAT GGT GGA TGC GAA GGG AAT GCT AAC 135 31 K CL EFI YGGC EGN AN 45 136 AAT TTT ATCACC AM GAG GM TGC GM AGC ACC TGT GCT GCC TGA 180 46 NFI TKE ECE STCAA* 60 。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι，它能够通过以分泌表达的方式大量生产获得，并具有较高的抑制plasmin的生物活性。该重组textilinin-Ι可以作为止血药，用于手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。本发明提供了ー种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι，其氨基酸序列为 KDRPDFCELP ADTGPCRVRF PSFYYNPDEK KCLEFIYGGC EGNANNFITK EECESTCAA 其特征在于，所述具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι，是通过将人工合成的
textilinin-1结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得，其中人工合成textilinin-Ι结构基因序列为
IAAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。本发明还提供了所述重组textilinin-Ι的制备方法，其特征在于，制备方法为将人工合成的textilinin-Ι结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生重组textilinin-Ι,其中人工合成textilinin-Ι结构基因序列最好为
IAAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 IKDR P DF CEL PA DTGP 15 46 TGTAGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 16 CRVRF PS FYY NP D E K 30 91 AAG TGT TTG GAATTT ATT TAC GGT GGT TGT GM GGT AAC GCT AAC 135 31 KCL EFIYGGC EGN A N 45 136 AAC TTT ATT ACT AAG GM GM TGTGAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180 46 NFI TKE ECE S T C A A * 60。优选地，本发明重组textilinin-Ι可以通过甲醇酵母菌以分泌表达的方式大量
产生获得。
本发明提供的重组textilinin-Ι的制备方法，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，依据textilinin-Ι的天然氨基酸序列，选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子，人工合成textilinin-Ι结构基因序列。本发明提供的重组textilinin-Ι的制备方法，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，将人工合成textilinin-Ι结构基因插入到甲醇酵母菌表达载体/7/YCaf或pPICZa 中。本发明提供的重组textilinin-Ι的制备方法，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时,可以利用酵母菌的α-信号肽，PHOl信号肽将重组textilinin-Ι移出细胞，其中在信号肽序列与textilinin-Ι序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列AAAAGA。本发明提供的重组textilinin-Ι的制备方法，其特征在于其发酵エ艺參数的优化为表达时pH值为3-5，表达温度为23-25°C。 本发明提供的重组textilinin-Ι的制备方法，其特征在于其纯化工艺为阳离子交换和阴离子交换，优化地选用Capto MMC和Q hp作为纯化textilinin-Ι的填料。本发明提供的具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι，在制造止血药物方面的用途。本发明提供的具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-Ι,可代替aprotinin止血药，作为副作用较低的止血药，用于外科手术中，尤其是用于体外循环下实施的冠状动脉旁路移植术(CABG)，以减少手术过程中的出血，并相应降低输血需求。
图I重组质粒示意 图2 PCR鉴定阳性转化子电泳結果；
图3 HPLC色谱纯度分析图谱；
图4 textilinin-Ι活性测定分析图。
具体实施例方式 实施例I
根据美国Genebank中公开的textilinin-1 (AF402324. I)的核酸序列,选择酵母菌喜好的遗传密码子，人工合成textilinin-Ι的结构基因序列。为使合成的目的基因重组到酵母菌分泌型表达载体PPICZ α中，在基因的5'端添加Xho I酶切位点，基因的3'端添加终
止密码子TAATGA及酶切位点NotI
。另外，在Xho I酶切位点与textilinin-Ι多肽的N-端第一个氨基酸密码子之间加入KEX2蛋白酶识别序列Lys-Arg对应的密码子AAAAGA,这就确保了 textilinin-Ι在分泌到发酵液时能够顺利地切除α-信号肽。重组质粒构建见图I。将合成的textilinin-Ι基因及pPICZa A载体经Xho I和Not I双酶切，电泳、
回收，将目的基因重组到PPICZaA中，转化到大肠杆菌ToplOF’中，进行筛选。转化有pPICZ a A的大肠杆菌ToplOF’在LB+25ug/mg Zeocin的平板上的进行培养,挑取单菌落，在液体培养基中培养，提取质粒，Xho I和Not I双酶切检测或进行α-factor priming和
3AOXl priming PCR检测，说明pPICZ a A中含有目的基因，可以用来转化/7ZcAia pastor isX-33, KM71H 或 GS115 宿主菌。设计的textilinin-Ι序列及酶切位点(Xhol/Notl)
Xhol kex2 site Q8008Y
CTCGAGAAAAGAAAGGATAGACCAGATTTTTGTGAATTGCCAGCTGATACTGGTCCATGTAGAGTTAGATTTCCATCTTTTTACTACAACCCAGATGAAAAGAAGTGTTTGGAATTTATTTACGGTGGTTGTGAAGGTAACGCTAACAACTTTATTACTAAGGAAGAATGTGAATCTACTTGTGCTGCTTAAGCGGCCGCNotl实施例2
用DNA限制性内切酶SacI将pPICZ a -Txn-I线性化,按照Invitrogen公司Multi-CopyPichia Expression Kit Version B中的方法制备酵母宿主感受态并进行转化,将转化后的细胞涂在YPD+500ug/ml Zeocin培养基上生长，30°C下放置3_4天可出现单菌落。挑选菌落大而饱满的克隆进行表达筛选。PCR鉴定阳性转化子(设阳性对照)如图2所示，其中阳性克隆为2,3,4,8,912 ， 13， 15 ， 14。实施例3
种子液在I. 5L酵母氮源基础培养基中28°C发酵24小时后转到30L发酵液中进行发酵培养。培养基H3PO4, 27ml/L; CaS04·2H20，O. 9g/L; K2SO4,18g/L; MgSO4*7H20, 15g/L;KOH, 4. 13g/L;甘油40g/L; 4. 4ml/L微量矿物质溶液。在发酵过程中，用NH4OH调pH值，使其维持在5. O。30°C通氧剧烈搅拌(700rpm)发酵，添加消泡剂。发酵24小时后，加入含12ml/L微量矿物质的50%甘油，溶氧浓度为20%左右，继续培养10小时。当碳原饥饿30分钟后，加入甲醇诱导，此时将pH值调到4. 0，表达温度调到23°C。刚开始的5小时加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母适应甲醇，100%甲醇含12ml/L微量矿物质溶液，其溶氧量在20%以上。继续发酵98小吋，textilinin-1表达量达到O. 4g/L。在其它发酵条件都基本相同的前提下，首先对诱导温度进行了优化，在同样pH
6.O的条件下,优化诱导温度对textilinin-Ι产量的影响,确定了最佳表达温度为23°C。其次进行了表达阶段pH的优化，在同样温度条件下，优化pH对textilinin-Ι产量的影响。下面是诱导表达阶段温度和PH优化实验数据
权利要求
1.ー种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-l，其氨基酸序列为 KDRPDFCELP ADTGPCRVRF PSFYYNPDEK KCLEFIYGGC EGNANNFITK EECESTCAA,其特征在于，所述具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-l，是通过将人工合成的textilinin-l结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生获得，其中人工合成textilinin-l结构基因序列为 I AAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。
2.—种权利要求I所述重组textilinin-l的制备方法，其特征在于，制备方法为将人工合成的textilinin-l结构基因在酵母菌中，或者在CHO细胞或其它哺乳动物细胞中，以分泌表达的方式大量产生重组textilinin-l,其中人工合成textilinin-l结构基因序列为 I AAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。
3.按照权利要求2所述重组textilinin-l的制备方法，其特征在于所述酵母菌为甲醇酵母菌。
4.按照权利要求3所述重组textilinin-l的制备方法，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，依据textilinin-l的天然氨基酸序列，选择甲醇酵母菌比较偏好的密码子，人工合成textilinin-l结构基因序列。
5.按照权利要求3所述重组textilinin-l的制备方法，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，将人工合成textilinin-l结构基因插入到甲醇酵母菌表达载体/7/Yd或pPICZa 中。
6.按照权利要求3所述重组textilinin-l的制备方法，其特征在于在甲醇酵母菌中实现分泌表达时，利用酵母菌的α_信号肽，PHOl信号肽将重组textilinin-l移出细胞，其中在信号肽序列与textilinin-l序列之间插入KEX2蛋白酶识别序列。
7.按照权利要求2或3所述重组textilinin-l的制备方法，其特征在于其发酵エ艺參数为表达时pH值为3-5，表达温度为23-25°C。
8.按照权利要求2或3所述重组textilinin-l的制备方法,其特征在于其纯化工艺为阳离子交換和阴离子交換。
9.按照权利要求8所述重组textilinin-l的制备方法,其特征在于选用CaptoMMC和Q hp作为纯化textilinin-l的填料。
10.权利要求I所述重组textilinin-l在制造止血药物方面的用途。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种具有抑制纤溶酶活性的重组textilinin-1及其制备方法和应用，通过分泌表达的方式大量生产获得重组textilinin-1，其具有较高的抑制plasmin的生物活性。该重组textilinin-1可以作为止血药，用于手术过程中纤维蛋白被纤溶酶溶解导致的失血过多。
文档编号C07K14/81GK102850451SQ20111017860
公开日2013年1月2日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者薛百忠, 徐梅, 杨宇, 张宏杰, 李娜, 刘剑, 邸伟庆, 刘宏大, 王宏英, 薛雁 申请人:辽宁诺康生物制药有限责任公司