专利名称：：纳米材料抑制酶活性的测定方法
技术领域：
：本发明属于纳米材料的环境毒理测定领域，具体涉及一种纳米材料抑制酶的活性的测定方法。
背景技术：
：微米技术是20世纪科学技术的象征，而纳米技术则是21世纪科学技术的象征。由于纳米材料独特的物理化学性质，如小尺寸效应、大的比表面积、极高的反应活性、量子效应等，导致异常的吸附能力、化学反应能力、分散与团聚能力等，使纳米科学与生命科学、信息科学共同成为当今世界的三大支柱科学。近年来随着纳米科技的迅速发展，已经创造出无数的人工纳米材料(至少有一维小于lOOnm的材料)，包括碳纳米管、巴基球和纳米氧化物颗粒等，其在光电、生物医药、化妆品、能源及催化等领域的应用日益广泛。目前在世界范围内，每年的使用量达1，000~2，000吨，并将在2011-2020年达到10,000-IOO，OOO吨(英国皇家学会和英国皇家工程学院，2004)。随着纳米材料的广泛使用，各种形式的纳米材料会通过不同的途径进入我们赖以生存的环境当中，可能会对人体及生态环境造成污染，从而危及人类健康。由于纳米材料的本身物理化学特性决定了其对生物体及环境具有潜在的影响，许多研究已经表明其潜在的毒理效应己引起广大学者的广泛关注，因此需要对纳米材料的安全性进行系统评估，以引导纳米技术的健康、持续发展。酶由生物体内细胞产生的一种生物催化剂，是细胞赖以生存的基础，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，如果受某些物质的影响造成酶的活性减弱，均可导致该酶催化的反应异常，使物质代谢紊乱，甚至发生疾病，这些物质称为酶的抑制剂。为了决定抑制剂对酶的活性产生的抑制作用，需要测定抑制剂存在情况下酶的活性的变化。从广义上说，任何一种可以测定反应物变化速度的分析技术都可用来测定酶的活性，但是从历史和发展来看，酵的活性测定的常用技术和方法主要有分光光度法，另外也有滴定法等其他方法。现有酶的活性抑制率测定方法的一般测定程序是将酶溶液和抑制物作用一段时间后，再加入相应酶的底物，测定酶的活性，进而得到纳米材料对酶的活性的抑制率。但是，由于纳米材料的特殊的吸附效应，会对反应系统中的物质产生不同程度的吸附，影响测定的精确度；还应该强调，采用现有方法时，由于纳米材料悬浮液的不稳定性，有些通过分光光度计测定酶促反应速率的变化表示酶的活性的测定方法，无法用来测定纳米材料对酶的活性的抑制率；另外，又由于纳米材料悬浮液不是澄清透明状的溶液，有些采用滴定法测定酶的活性的方法难以判断滴定终点，也无法用来测定纳米材料对酶的活性的抑制率。因此，为了确定纳米材料对酶的活性产生的抑制作用，也就是测定纳米材料对酶的活性的抑制率，常常不能按照现有的一般测定方法进行分析，而大大限制了纳米材料对酶的活性的抑制率的测定。
发明内容本发明的目的是提供一种纳米材料抑制酶的活性的测定方法，以弥补现有技术的不足。本发明的测定程序是将酶溶液和纳米材料悬浮液混合相互作用后，先离心分离上清液和沉淀物，并按照常规酶的活性的测定方法测定出该上清液中的酶的活性，进而得到纳米材料对酶的吸附率E;再向上述离心后的沉淀物中加入相应酶的缓冲液，重新悬浮，充分解吸后离心，测定以解吸附率D表示的纳米材料吸附酶的活性，即纳米材料所吸附酶的解吸附率D;最后利用公式IE=E-D，计算纳米材料对酶的活性的抑制率IE。本发明的技术方案是首先将酶溶液和作为抑制物的纳米材料的悬浮液混合相互作用一段时间后，再加入相应酶的底物，测定酶的活性，进而得到纳米材料对酶的活性的抑制率；其特征是将酶溶液和纳米材料悬浮液混合相互作用后，先离心分离出上清液和沉淀物，并按照常规酶的活性的测定方法测定出该上清液中的酶的活性，进而得到纳米材料对酶的吸附率E;再向上述离心后的沉淀物中加入相应酶的缓冲液重新悬浮，充分解吸后离心，测定以解吸附率表示的纳米材料吸附酶的活性，即纳米材料所吸附酶的解吸附率D;最后利用公式IE=E-D，计算纳米材料对酶的活性的抑制率IE。本发明的纳米材料抑制酶的活性是以纳米材料对酶的活性的抑制率IE来表达。本发明的纳米材料包括在水中不能溶解的所有人工纳米材料。即上述的纳米材料为在水中不能溶解的人工纳米材料都适用本发明。本发明的酶包括能用分光光度法或滴定法测定其活性的所有酶，也就是本发明广泛适用于能用分光光度法或滴定法测定其活性的酶，即上述的酶是限定能用分光光度法或滴定法测定其活性的若干种酶。因此本发明有广泛的适用性。本发明方法通过纳米材料和酶作用后离心除去纳米材料，克服了现有技术测定程序中纳米材料对后续加入物质及反应产物的吸附而对结果造成的影响；而且，通过充分解吸，测定纳米材料吸附的酶的活性，因此更准确地计算出纳米材料对酶的抑制率，大大提高了测定纳米材料抑制酶的活性的精确度和重现性，适用于在水中不能溶解的人工纳米材料以及能用分光光度法和滴定法测定其活性的若干种酶，而具有广泛的适用性，特别是采用现有方法，由于纳米材料悬浮液的不稳定性，有些通过分光光度计测定酶促反应速率的变化表示酶的活性的测定方法，无法用来测定纳米材料对酶的活性的抑制率。另外，由于纳米材料悬浮液不是澄清透明状的溶液，有些采用滴定法测定酶的活性的方法难以判断滴定终点，采用现有方法也无法用来测定纳米材料对酶的活性的抑制率，而本发明不受这些因素的限制。因此可望成为纳米材料抑制酵的活性的标准测定方法。具体实施例方式本发明先将酶溶液和纳米材料悬浮液在玻璃容器中混匀后，使纳米材料和酶作用10min-2h，再用冷冻离心机在10000卬m-15000卬m4。C离心3-10min，分离上清液与离心后的沉淀物，(其中沉淀物中包括纳米材料及其吸附的酶)。然后按照常规酶的活性的测定方法测定出该上清液中的酶的活性，进而得到纳米材料对酶的吸附率E;(纳米材料所吸附酶的活性通过解吸附率D表示)，再向上述离心后的沉淀物中加入酶的缓冲液，重新悬浮，在4。C下剧烈振荡10-60min，使吸附的酶充分解吸，再用冷冻离心机在10000rpm-15000rpm和4。C离心3-10min,然后再测定上清液中的酶的活性，进而得到酶的解吸附率D;最后利用吸附率和解吸附率计算纳米材料对酶的活性的抑制率IE。即以公式计算出抑制率IE-E-D,(即抑制率-吸附率一解吸附率)。以下选用八种纳米材料和不同的各种酶为例，并以现有方法进行比对。实施例l以乙酰胆碱酯酶为例现有方法用pH8.0的磷酸缓冲液制备5U/ml的乙酰胆碱酯酶溶液和250mg/L、25mg/L、12.5mg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管(L-MWNTs-1020)、单壁碳纳米管(L-SWNTs)、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每种纳米材料悬浮液中加入乙酰胆碱酯酶溶液，混合均匀，使纳米材料和乙酰胆碱酯酶作用15min后，再加入乙酰胆碱酯酶的底物，测定酶的活性，进而得到纳米材料对乙酰胆碱酯酶的抑制率。本发明方法用pH8.0的磷酸缓冲液制备5U/ml的乙酰胆碱酯酶溶液和250mg/L、25mg/L、12.5mg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每种纳米材料悬浮液中加入乙酰胆碱酯酶溶液，混合均匀，使纳米材料和乙酰胆碱酯酶作用15min后，用冷冻离心机在12000rpm4'C离心5min，分离上清液和沉淀物，并测定该上清液中乙酰胆碱酯酶的活性，进而得到纳米材料对乙酰胆碱酯酶的吸附率E;再向上述离心后的沉淀物中加入pH8.0的磷酸缓冲液，重新悬浮，剧烈振荡30min，使纳米材料吸附的乙酰胆碱酯酶充分解吸后离心，测定以解吸附率D表示的纳米材料吸附乙酰胆碱酯酶的活性，即纳米材料所吸附乙酰胆碱酯酶的解吸附率D;最后利用公式IE3-D，计算结果如下表l:表1不同浓度的八种纳米材料对乙激<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2以硝酸还原酶为例现有方法用pH7.5的磷酸缓冲液制备5U/ml的硝酸还原酶溶液和50mg/L、25mg/L、12.5mg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每种纳米材料悬浮液中加入硝酸还原酶溶液，混合均匀，使纳米材料和硝酸还原酶作用30min后，再加入硝酸还原酶的底物，通过分光光度法测定酶的活性，进而得到纳米材料对硝酸还原酶的抑制率。本发明方法用pH7.5的磷酸缓冲液制备5U/ml的硝酸还原酶溶液和50mg/L、25mg/L、12.5mg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及八1203，向每种纳米材料悬浮液中加入硝酸还原酶溶液，混合均匀，使纳米材料和硝酸还原酶作用30min后，用冷冻离心机在12000rpm4'C离心5min,分离上清液和沉淀物，并通过分光光度法测定该上清液中硝酸还原酶的活性，进而得到纳米材料对硝酸还原酶的吸附率E;再向上述离心后的沉淀物中加入pH7.5的磷酸缓冲液，重新悬浮，剧烈振荡30min，使米材料吸附的硝酸还原酶充分解吸后离心，测定以解吸附率D表示的纳米材料吸附硝酸还原酶的活性，即纳米材料所吸附硝酸还原酶的解吸附率D;最后利用公式IE=E-D,计算结果如下表2:表2不同浓度的八种纳米材料对硝酸还原酶的活性的抑制率实施例3以过氧化物酶为例现有方法用pH7.0的磷酸缓冲液制备5U/ml的过氧化物酶溶液和100mg/L、50mg/L、10mg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及Al2Cb，向每种纳米材料悬浮液中加入过氧化物酶溶液，混合均匀，使纳米材料和过氧化物酶作用30min后，再加入过氧化物酶的底物，通过分光光度法测定酶的活性随时间的变化率，进而得到纳米材料对过氧化物酶的抑制率。本发明方法用pH7.0的磷酸缓冲液制备5U/ml的过氧化物酶溶液和100mg/L、50mg/L、10mg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及Al203，向每种纳米材料悬浮液中加入过氧化物酶溶液，混合均匀，使纳米材料和过氧化物酶作用30min后，用冷冻离心机在12000卬m4'C离心5min，分离上清液和沉淀物，并通过分光光度法测定该上清液中过氧化物酶的活性随时间的变化率，进而得到纳米材料对过氧化物酶的吸附率E;再向上述离心后的沉淀物中加入pH7.0的磷酸缓冲液，重新悬浮，剧烈振荡30min,使米材料吸附的过氧化物酶充分解吸后离心，测定以解吸附率D表示的纳米材料吸附过氧化物酶的活性，即纳米材料所吸附过氧化物酶的解吸附率D;最后利用公式IE=E_D，计算结果如下表3。过氧化物酶的活性的测定是通过分光光度法测定酶促反应速率的变化表示酶的活性，由于纳米材料悬浮液的不稳定性，采用现有方法无法测定酶促反应速率的变化，因而无法得到纳米材料对酶的活性的抑制率，采用本发明测定的抑制率见下表3。表3不同浓度的八种纳米材料对过氧化物酶的活性的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例4以过氧化氢酶为例基本方法用pH7.0的磷酸缓冲液制备5U/ml的过氧化氢酶溶液和100mg/L、50mg/L、lOmg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及Al2Cb，向每种纳米材料悬浮液中加入过氧化氢酶溶液，混合均匀，使纳米材料和过氧化氢酶作用30min后，再加入过氧化氢酶的底物，通过滴定法测定酶的活性，进而得到纳米材料对过氧化氢酶的抑制率。本发朋方法用pH7.0的磷酸缓冲液制备5U/ml的过氧化氢酶溶液和100mg/L、50mg/L、lOmg/L的纳米材料悬浮液，选用以下八种纳米材料，包括多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、Cu、Al、碳包铜(Cu-C)、Ti02、Si02及Alz03，向每种纳米材料悬浮液中加入过氧化氢酶溶液，混合均匀，使纳米材料和过氧化氢酶作用30min后，用冷冻离心机在12000rpm4'C离心5min，分离上清液和沉淀物，并通过滴定法测定该上清液中过氧化氢酶的活性，进而得到纳米材料对过氧化氢酶的吸附率E。再向上述离心后的沉淀物中加入pH7.0的磷酸缓冲液，重新悬浮，剧烈振荡30min，使米材料吸附的过氧化氢酶充分解吸后离心，测定以解吸附率D表示的纳米材料吸附过氧化氢酶的活性，即纳米材料所吸附过氧化氢酶的解吸附率D;最后利用公式IE=E-D,计算结果如下表4。过氧化氢酶的活性是通过滴定法进行测定，由于纳米材料悬浮液不是澄清透明状的溶液,采用现有方法测定时难以判断滴定终点，因而无法得到纳米材料对酶的活性的抑制率，采用本发明测定的抑制率见下表4。表4不同浓度的八种纳米材料对过氧化氢酶的活性的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1、纳米材料抑制酶的活性的测定方法，将酶溶液和作为抑制物的纳米材料的悬浮液混合相互作用一段时间后，再加入相应酶的底物，测定酶的活性，进而得到纳米材料对酶的活性的抑制率；其特征是将酶溶液和纳米材料悬浮液混合相互作用后，先离心分离出上清液和沉淀物，并按照常规酶的活性的测定方法测定出该上清液中的酶的活性，进而得到纳米材料对酶的吸附率E；再向上述离心后的沉淀物中加入相应酶的缓冲液重新悬浮，充分解吸后离心，测定以解吸附率表示的纳米材料吸附酶的活性，即纳米材料所吸附酶的解吸附率D；最后利用公式IE＝E-D，计算纳米材料对酶的活性的抑制率IE。2、如权利要求l所述的纳米材料抑制酶的活性的测定方法，其特征是上述的纳米材料为在水中不能溶解的人工纳米材料。3、如权利要求2所述的纳米材料抑制酶的活性的测定方法，其特征是上述的人工纳米材料为碳纳米管、纳米金属和纳米金属氧化物。4、如权利要求3所述的纳米材料抑制酶的活性的测定方法，其特征是上述的碳纳米管为多壁碳纳米管和单壁碳纳米管。5、如权利要求3所述的纳米材料抑制酶的活性的测定方法，其特征是上述的纳米金属是Cu、Al和碳包铜。6、如权利要求3所述的纳米材料抑制酶的活性的测定方法，其特征是上述的纳米金属氧化物是Ti02、Si02和A1203。7、如权利要求l所述的纳米材料抑制酶的活性的测定方法，其特征是上述的酶是限定能用分光光度法或滴定法测定其活性的若干种酶。全文摘要本发明涉及一种纳米材料抑制酶的活性的测定方法。其特征是首先将酶液和纳米材料悬浮液混合作用后离心，测定上清液中的酶的活性，得到纳米材料对酶的吸附率E；再向上述沉淀物中加入酶的缓冲液，充分解吸后离心，测定纳米材料对酶的解吸附率D。最后利用公式IE＝E-D计算纳米材料对酶的活性的抑制率IE。本发明克服了纳米材料对后续加入物质及反应产物的吸附效应造成的影响，通过纳米材料吸附的酶的活性的测定，大大提高了测定纳米材料抑制酶的活性的精确度和重现性，适于在水中不能溶解的所有人工纳米材料，其中酶是限定能用分光光度法或滴定法测定其活性的若干种酶，因此具有广泛的适用性。可望成为纳米材料抑制酶的活性的标准测定方法。文档编号G01N21/25GK101329255SQ20081013840公开日2008年12月24日申请日期2008年7月16日优先权日2008年7月16日发明者李锋民,王震宇,建赵,高冬梅申请人:中国海洋大学