专利名称：一种能抑制血管紧张素酶活性的寡聚肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用复合酶定向酶解茄参胶原蛋白制取能够抑制血管紧张素酶活性的寡聚肽的方法背景技术原发性高血压是由多种因素引起的，其中包括遗传、饮食习惯、精神状态等。研究表明血压正常与否，与肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统密切相关，而血管紧张素酶(ACE)在上述两个系统中都起着重要作用。在肾素-血管紧张素系统中，ACE水解无升压活性的血管紧张素I，生成具有升压活性的血管紧张素II；而在激肽释放酶-激肽系统中，ACE能够降解具有降压活性的缓激肽，使之失去降血压活性。ACE通过以上两种途径参与了体内血压调节，能造成血压的升高，引发高血压。ACE抑制剂通过抑制血浆和血管内皮细胞ACE的活性达到降低血压的目的。ACE抑制剂的研究始于20世纪60年代，Ferreira等人在南美洲蝮蛇(Bothrops jararaca)毒液中发现ACE抑制剂，之后人们对于ACE抑制剂的机理、提取及合成进行了广泛研究，1981年第一个合成ACE抑制剂Captopril(商品名为卡普托利)经FDA批准上市。目前合成ACE抑制剂是临床上广泛应用的一种降血压药物，但由于它具有干咳、血管性水肿等副作用，人们试图寻找更为安全的ACE抑制剂。1979年Oshima等人用细菌胶原酶降解明胶获得具有较强ACE抑制活性肽，这是人类第一次利用食品蛋白质得到的食源性ACE抑制活性肽，之后人们先后从日本清酒、沙丁鱼、蛋黄、酸奶、鲣鱼等食品原料中获得食源性ACE抑制活性肽。食源性ACE抑制活性肽安全性高，降压效果温和、专一、持久，且无副作用，但它的缺点是成本高，对ACE的抑制作用差。
目前，尚未见到用茄参胶原蛋白制备ACE抑制活性肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用复合酶定向酶解茄参胶原蛋白制取能抑制血管紧张素酶活性的寡聚肽的方法，它能克服现有技术的上述缺陷。
一种能抑制血管紧张素酶活性的寡聚肽的制备方法，其特征是将茄参体壁用蒸馏水打浆，离心，残渣用碱溶液搅拌过夜，离心，重复用碱洗，除去上清液，沉淀用蒸馏水冲洗至中性，加入蒸馏水恒温加热并搅拌抽提，离心分离得热水提胶原溶液，冷冻干燥，得到茄参胶原蛋白，将该茄参胶原蛋白溶解于磷酸-柠檬酸缓冲液中配成溶液，加入菠萝蛋白酶，恒温搅拌，水解，灭酶，冷却，超滤膜超滤；用碱液调pH7-8，再加入Alcalase蛋白酶，恒温水解，灭酶，冷却，超滤膜超滤；加I型胶原酶，恒温水解，灭酶，冷却，超滤膜超滤，得水解液，经过阳离子交换柱、凝胶柱、两次反相高压液相色谱半制备柱分离纯化后冻干。
本发明以低值的茄参为原料，利用菠萝蛋白酶、Alcalase蛋白酶、I型胶原酶复合酶解制备具有ACE抑制活性的寡聚肽，所得产物活性高，对ACE酶有较好的抑制作用。
具体实施例方式
将1kg茄参体壁加入2.5kg的蒸馏水打浆，离心，所得残渣用8kg的NaOH水溶液搅拌过夜，离心，重复用NaOH的水溶液洗三次，除去上清液，沉淀用蒸馏水冲洗至中性，加入蒸馏水45℃下恒温加热并搅拌抽提8h，离心分离得胶原水溶液，冷冻干燥。将所得茄参胶原蛋白溶解于磷酸-柠檬酸缓冲液(该缓冲溶液的摩尔浓度为0.02M，pH4.5)中配成0.5～1.5％(重量百分比浓度，下同)，最好是1％的溶液，按照4000～5000U/g，最好4500U/g胶原蛋白加菠萝蛋白酶，恒温搅拌，40～50℃下，最好45℃下水解3～5小时，最好4小时，95～100℃下灭酶，冷却，用10KDa超滤膜超滤；用碱液调pH7～8，最好7.5，按照2500～3500U/g，最好3000U/g胶原蛋白加入Alcalase蛋白酶，50～60℃下，最好55℃恒温水解1.5～2.5小时，最好2小时，95℃下灭酶，冷却，用5KDa超滤膜超滤；使pH值不变，按照3500～4500U/g，最好4000U/g胶原蛋白加入I型胶原酶，36～38℃下，最好37℃下恒温水解3～4小时，最好4小时，95℃灭酶，冷却，用1KDa超滤膜超滤，所得水解液经过SP Sephadex C-25阳离子交换柱、Sephadex G-15凝胶柱，两次反相高压液相色谱C18半制备柱分离纯化，冻干即得到具有ACE抑制活性的寡聚肽。
采用分光光度计法测定，分子量在1K以下的本发明的寡聚肽对ACE有较好的抑制效果，其IC50值为23.8ug/ml。
权利要求
1.一种能抑制血管紧张素酶活性的寡聚肽的制备方法，其特征是将茄参体壁用蒸馏水打浆，离心，残渣用碱溶液搅拌过夜，离心，重复用碱洗，除去上清液，沉淀用蒸馏水冲洗至中性，加入蒸馏水恒温加热并搅拌抽提，离心分离得热水提胶原溶液，冷冻干燥，得到茄参胶原蛋白，将该茄参胶原蛋白溶解于磷酸-柠檬酸缓冲液中配成溶液，加入菠萝蛋白酶，恒温搅拌，水解，灭酶，冷却，超滤膜超滤；用碱液调pH7-8，再加入Alcalase蛋白酶，恒温水解，灭酶，冷却，超滤膜超滤；加I型胶原酶，恒温水解，灭酶，冷却，超滤膜超滤，得水解液，经过阳离子交换柱、凝胶柱、两次反相高压液相色谱半制备柱分离纯化后冻干。
全文摘要
一种能抑制血管紧张素酶活性的寡聚肽的制备方法，其特征是将茄参体壁用水打浆，离心，残渣用碱搅拌，离心，用碱液洗，除去上清液，沉淀用水冲洗至中性，加水恒温，加热并搅拌抽提，离心分离得热水提胶原溶液，冷冻干燥，得到茄参胶原蛋白，将后者溶于磷酸－柠檬酸缓冲液中，加入菠萝蛋白酶，恒温搅拌，水解，灭酶，冷却，超滤膜超滤；调pH7－8，再加入Alcalase蛋白酶，恒温水解，灭酶，冷却，超滤；加I型胶原酶，恒温水解，灭酶，冷却，超滤，得水解液，经交换柱、凝胶柱、两次反相高压液相色谱半制备柱分离纯化后冻干。本发明以低值的茄参为原料制得的寡聚肽活性高，对ACE酶有较好的抑制作用。
文档编号A61K36/185GK1858230SQ20061004448
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者曾名湧, 赵元晖, 刘尊英, 董士远, 李八方 申请人:中国海洋大学