专利名称：一种能清除超氧阴离子的寡聚肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用复合酶定向酶解罗非鱼皮制取具有清除超氧阴离子自由基活性的寡聚肽的方法。
背景技术：
近年来研究发现，许多危害人体健康的疾病如癌症、衰老、心血管疾病、代谢失调、光损伤、白内障、肌肉损伤、毒物侵害，甚至疲劳等都与人体内的自由基有关，如何清除人体内的自由基成为营养保健学科的一个研究热点。因此抗氧化剂不仅用于含脂肪食品的抗氧化，而且更为重要的是作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。目前，自由基清除剂的种类很多，但由于化学合成的自由基清除剂的不安全性和人们保健意识的增强，对自由基清除剂在食品中应用的要求越来越严格，人们把目光逐步转向从各种植物、动物组织中提取天然的自由基清除剂，如茶叶中的茶多酚、大豆中的大豆异黄酮、骨骼肌中的肌肽、枸杞中的枸杞多糖、大豆蛋白分解得到的大豆肽以及慈菇、扇贝、六月霜的提取物等等。但这些产品的缺点是成本高，清除超氧阴离子自由基的效果差。目前国内还没有从鱼皮胶原蛋白中提取能清除超氧阴离子的寡聚肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用复合酶定向酶解罗非鱼皮制备具有清除超氧阴离子的自由基活性的寡聚肽的方法，该寡聚肽具有低毒、高效的特点，可以克服现有自由基清除剂的上述缺陷。
一种能清除超氧阴离子的寡聚肽的制备方法，其特征是将罗非鱼皮依次分别在氢氧化钠水溶液、硫酸水溶液和柠檬酸水溶液中浸泡，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后将鱼皮用蒸馏水打浆，恒温下搅拌提取，然后离心，将所得上清液冻干得到罗非鱼皮胶，将该罗非鱼皮胶用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解，加入菠萝蛋白酶，恒温搅拌酶解，然后灭酶，冷却，用碱调pH，再加入Alcalase酶，恒温搅拌酶解，灭酶，冷却，离心，以清除超氧阴离子的IC50值为指标，取上清液，经过超滤、凝胶柱层析、阳离子交换柱层析、凝胶柱脱盐、反相高相液相色谱分离纯化后，冻干。
本发明以低值的罗非鱼皮为原料，利用菠萝蛋白酶和Alcalase酶复合酶解制备寡聚肽，所得产物对超氧阴离子具有较好的清除效果。
具体实施例方式
将罗非鱼皮40～60克(最好是50克)，依次分别加入6～8倍(最好是7倍)皮重的0.2％(重量百分浓度，下同)氢氧化钠水溶液、0.2％硫酸水溶液和1％柠檬酸水溶液各浸泡30～50分钟(最好是40分钟)，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后将鱼皮加入8～12倍(最好是10倍)蒸馏水打浆，40-50℃下，最好是45℃下恒温搅拌提取10～14小时(最好是12小时)，然后离心，将上清液冻干得到罗非鱼皮胶。将该罗非鱼皮胶加入其18～22倍(最好是20倍)重量的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解，按照3800～4200u/g(最好是4000u/g)罗非鱼皮胶的比例加入菠萝蛋白酶，40-50℃下，最好是45℃下恒温搅拌酶解3～5小时(最好是4小时)，然后灭酶，冷却。用碱液调pH至7.5，按照5800～6200u/g(最好是6000u/g)与罗非鱼皮胶的比例加入Alcalase酶，50-60℃下，最好是55℃下恒温搅拌酶解1～3小时(最好是2小时)，灭酶，冷却，离心，上清液经过超滤，以各组分清除超氧阴离子的IC50值为指标，收集分子量小于1000Da的部分，再经过Sephadex G-25凝胶柱层析、SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析、Sephadex G-15凝胶柱脱盐、反相高相液相色谱分离纯化后，即得到本发明的能清除超氧阴离子的寡聚肽。
采用邻苯三酚自氧化法测定各组分对超氧阴离子的清除效果，以对超氧阴离子抑制率达到50％时所需的浓度即IC50值为指标，实验结果如下所得寡聚肽清除超氧阴离子的IC50值为4.95μg/mL，小于目前常用的自由基清除剂Vc的IC50值6.80μg/mL，这说明本发明的寡聚肽的自由基清除效果好于Vc。经过质谱分析，该寡聚肽的分子量主要集中在311.3～932.8Da。
权利要求
1.一种能清除超氧阴离子的寡聚肽的制备方法，其特征是将罗非鱼皮依次分别在氢氧化钠水溶液、硫酸水溶液和柠檬酸水溶液中浸泡，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后将鱼皮用蒸馏水打浆，恒温下搅拌提取，然后离心，将所得上清液冻干得到罗非鱼皮胶，将该罗非鱼皮胶用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解，加入菠萝蛋白酶，恒温搅拌酶解，然后灭酶，冷却，用碱调pH，再加入Alcalase酶，恒温搅拌酶解，灭酶，冷却，离心，以清除超氧阴离子的IC50值为指标，取上清液，经过超滤、凝胶柱层析、阳离子交换柱层析、凝胶柱脱盐、反相高相液相色谱分离纯化后，冻干。
全文摘要
一种能清除超氧阴离子的寡聚肽的制备方法，其特征是将罗非鱼皮依次分别在氢氧化钠水溶液、硫酸水溶液和柠檬酸水溶液中浸泡，每次浸泡后均用水清洗至中性，然后将鱼皮用蒸馏水打浆，恒温下搅拌提取，然后离心，将所得上清液冻干得到罗非鱼皮胶，将后者用柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液溶解，加入菠萝蛋白酶，恒温搅拌酶解，然后灭酶，冷却，用碱液调pH，再加入Alcalase酶，恒温搅拌酶解，灭酶，冷却，离心，以清除超氧阴离子的IC
文档编号A61P39/06GK1858229SQ20061004448
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者曾名湧, 郭瑶, 董士远, 刘尊英, 李八方 申请人:中国海洋大学