一种同时筛选超氧阴离子清除剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种快速同时筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂和超 氧阴离子清除剂的新方法。 技术背景
[0002] 黄嘌呤氧化酶是人体内一种非常重要的酶，由于其重要的生物功能最近几十年 被广泛研宄。黄嘌呤氧化酶在嘌呤代谢过程中发挥着极其重要的作用，它可以催化次黄 嘌呤氧化生成黄嘌呤，并进一步催化黄嘌呤氧化生成尿酸，并且在这一过程中伴随有超 氧阴离子的生成。过量产生的尿酸会沉积在关节处形成炎症反应，造成痛风。而超氧阴 离子不仅具有重要的生物功能，还与多种疾病如炎症、癌症、糖尿病、老年痴呆、动脉粥样 硬化以及衰老等有密切联系（参见：Harris M D, Siegel L B, Alloway J A. Gout and hyperuricemia[J]. American Family Physician, 1999, 59(4) :925-934 ；R. Stocker, J. F.Keaney Jr. New insights on oxidative stress in the artery wall[J]. Journal of Thrombosisand Haemostasis, 2005, 3(8):1825-1834 ；B Halliwell, DSc(Prof). Free radicals, antioxidants,and human disease : curiosity, cause, orconseque nce [J] · The Lancet, 1994, 344 (8924) : 721-724.等）。黄嘌呤氧化酶抑制剂可以阻 断尿酸的合成，减少体内氧自由基的产生，因而黄嘌呤氧化酶抑制剂可以用来治疗高 尿酸血症、痛风以及与活性氧自由基相关的许多疾病（参见：Bryan T. Emmerson. The Management of Gout[J]. The New England Journal of Medicine, 1996, 334(7):445-451 ； Cristine E.Berry, Joshua M. Hare. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease:molecularmechanisms and pathophysiological implications[J]. The Journal of Physiology, 2004, 555 (3) : 589-606.等）。目前，已经有上市的黄嘌呤氧化酶抑制剂在 临床上应用于治疗痛风等疾病，如别嘌呤醇和非布索坦。长期的临床应用表明，别嘌呤醇和 非布索坦具有良好的治疗效果，但是它们都存在较严重的不良反应。目前亟需寻找毒副作 用更小、耐受性更好的黄嘌呤氧化酶抑制剂。
[0003] 由于黄嘌呤氧化酶会导致组织内超氧阴离子的升高，因此黄嘌呤氧化酶抑制剂 也会一定程度上具有超氧阴离子清除活性。然而在具有超氧阴离子清除活性的药物筛选 中，需要分辨该活性是否是由于药物本身具有黄嘌呤氧化酶抑制活性所引起的，以防止候 选药物的黄嘌呤氧化酶抑制活性干扰超氧阴离子清除活性药物筛选的结果。在实际的药 物筛选中，一般是将候选药物分别采用独立的黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子清除剂的 筛选方法，最后再将两个检测结果进行综合比对，但是这样的方法对样品的需求量大，并且 实验工作量大，而且由于是两次独立的实验，实验结果数据之间的平行性和重现性较差。 CN103364519A中公开了一种黄嘌呤氧化酶抑制剂和/或超氧阴离子清除剂的筛选方法，是 采用黄嘌呤氧化酶-薄层色谱生物自显影技术和生物活性测定相结合的药物筛选方法，但 是该方法无法对药物的活性进行定量，并且所述方法中还存在大量的其他干扰物质，极易 产生假阳性和假阴性结果。因此，在实际使用中还需要许多后续的实验来重复验证实验结 果的可靠性；使得该方法仍不能独立地同时得到可靠的药物筛选结果。因此，建立一种快 速、灵敏、准确地能同时从中药等天然产物中寻找新的高效、低毒的黄嘌呤氧化酶抑制剂和 超氧阴离子清除剂的筛选方法，具有极其广阔的前景。
[0004] 黄嘌呤氧化酶抑制活性可以通过对黄嘌呤氧化酶的酶促反应的终产物--尿酸 含量的变化进行评价，而尿酸的量可通过微板法或HPLC检测（HPLC法体外筛选黄嘌呤氧化 酶抑制剂，孙永新，赵焕新，白虹，药物分析杂志，2014年，34 (8)，1391-1396页）。由于存在 成分分离、以及对峰型的影响等困难，现有的文献在测定黄嘌呤氧化酶抑制活性时只是对 尿酸进行单独的检测。超氧阴离子作为酶促反应的副产物，超氧阴离子清除活性检测、定 量的方法主要有电子自旋共振法、化学发光法（鲁米诺、光泽精等）、分光光度法（硝基四 氮唑蓝NBT还原法和细胞色素 C还原法）和电化学法等，这些方法常用来评价化合物的超 氧化物清除活性，但是这些方法易产生假阳性和假阴性结果，荧光探针是一种灵敏度高的 测定超氧阴离子清除活性的方法，但是由于活性氧寿命短、反应活性高、难以捕捉，并且每 一种活性氧都有它独特的生理学活性，因此设计高选择性的适合某种特定的活性氧的荧光 探针以及合适的检测方法和检测条件是需要反复优选的，否则可能无法达到理想的检测结 果（检测活性氧的荧光探针新进展，章舒祺，魏永锋，光谱实验室，2009年，26 (4)，794-802 页）。
[0005] 氢化乙啡啶（hydroethidine, HE ;dihydroethidium, DHE)是一种特异性的焚光染 料，其结构如化学式（A)所示，一般HE的制备是通过还原溴乙锭（Ethidium bromide, EB) 而得到。HE具有细胞膜透性，能够被02-·氧化生成特异性荧光产物2-羟基胡米胺 (2-hydroxyethidium, 2-OH-E+)，结构如化学式（B)，它的最大激发波长为480nm，最大发射 波长为586nm。HE与其他的氧自由基，如0N00-、OH ·、H202和细胞色素 C、肌红蛋白、辣根 过氧化物酶等也可以发生反应，但生成与2-OH-E+完全不同的产物胡米胺（ethidium, E+)， 结构如化学式（C)，其最大激发波长和最大发射波长分别为518nm、603nm。因而，HE可以特 异性用作超氧阴离子（02- ·)检测的荧光探针。
【主权项】
1. 一种同时筛选超氧阴离子清除剂和黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，其特征在于，包括 以下步骤： 采用荧光探针和黄嘌呤氧化法测定样品的抗氧化能力，将所要检测的样品与反应体系 混合，对反应体系中的荧光探针与超氧阴离子的特异性产物2-0H-E+的生成量的改变进 行测定，根据体系中2-0H-E+生成量的减少来计算样品的0, ?的清除率。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用HPLC法对反应体系中的荧光探针HE 与超氧阴离子的特异性产物2-0H-E+的生成量的改变进行测定。
3. -种荧光探针耦联液质联用技术同时筛选超氧阴离子清除剂和黄嘌呤氧化酶抑制 剂的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)缓冲液配制：精密称取KH2PO4O. 0956g、K2HP04 ? 3H20 0. 6946g，EDTAI. 862mg，超纯 水定容至50mL，即得含75mmol/L磷酸根离子，pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液。 ⑵底物的配制：用〇. 1摩尔/升的NaOH溶液溶解配制40mmol/L的黄嘌呤标准溶液。 使用前再加磷酸盐缓冲液稀释即得400ymol/L底物溶液，底物溶液需每天新鲜配制。 (3) 酶的配制：用磷酸缓冲盐溶液配制5U/mL的黄嘌呤氧化酶（XOD)储备液，并保存 于-80°C冰箱中；使用前取出，用磷酸缓冲盐溶液配制成0. 08U/mL工作酶液，置于冰上保 存；为避免反复冻融降低酶的活性，每次实验前需预估所需酶量，取适量黄嘌呤氧化酶储备 液配制成工作酶液。 (4) 待测样品的配制：用二甲基亚砜溶解样品配制成lOOmmol/L的标准溶液，于-20°C 条件下避光保存，使用前取出，用磷酸缓冲盐溶液配制成400ymol/L溶液，DMSO含量应不 超过5%。 (5) 荧光探针的配制：在厌氧、避光条件下用二甲基亚砜溶解探针配制成20mmol/L的 储备溶液，于_80°C条件下避光保存，使用前取出，用磷酸缓冲盐溶液配制成200ymol/L 溶液，置于冰上避光保存。 (6) 对照品、空白样品和样品的酶促反应 对照品的配制：反应总体积200yL，终浓度0. 02U/mL的黄嘌呤氧化酶在37°C下孵育 2min，加入终浓度100ymol/L的底物黄嘌呤和终浓度50ymol/L的荧光探针溶液启动反 应，37 °C下孵育5min后，加入400yL乙腈终止反应，加入终浓度为6ymo1/L的内标加兰他 敏，涡旋后13000g离心10min，取上清液作为对照品，供超高效液相色谱-质谱联用测定。 空白样品的配制：反应总体积200yL，不加黄嘌呤氧化酶，加入终浓度100ymol/L的 底物黄嘌呤和终浓度50ymol/L的荧光探针溶液，37°C下孵育5min后，加入400yL乙腈终 止反应，加入终浓度为6ymol/L的内标加兰他敏，涡旋后13000g离心10min，取上清液作为 空白样品，供超高效液相色谱-质谱联用测定。 样品的配制：反应总体积200yL，将终浓度100ymol/L的样品溶液与终浓度0. 02U/mL的黄嘌呤氧化酶在37°C下共同孵育2min，加入终浓度100ymol/L的底物黄嘌呤和终浓度 为50ymol/L的荧光探针溶液启动反应，37°C下孵育5min后，加入400yL乙腈终止反应， 加入终浓度为6ymol/L的内标加兰他敏，涡旋后13000g离心10min，取上清液作为样品，供 超高效液相色谱-质谱联用测定。 (7) 对照品、空白样品和样品的检测： 对照品、空白样品和样品检测均按下述的超高效液相色谱和质谱条件分别进行检测， 得到HPLC-MS检测结果： ① 所述的高效液相条件如下： 色谱柱：4. 6X50mm,I. 8Um(Aglient-SB-Aq) 流动相：〇. 1 %甲酸水溶液（A)-O. 1 %甲酸乙腈（B) 梯度洗脱程序：〇 ~3min:1%B，3 ~5min:1 ~30%B，5~IOmin:30%B; 流速：1.OmT,/min进样量：15yL ② 所述的质谱条件如下： 离子源：电喷雾正离子模式 干燥氮气流速：llL/min 干燥气体温度：300°C 雾化压力：35psig毛细管电压：3000V 裂解电压：120V (8)样品对黄嘌呤氧化酶抑制率和超氧阴离子清除率的计算 根据样品的HPLC-MS检测结果 样品对黄嘌呤氧化酶抑制率可以通过HPLC-MS检测结果所显示的反应产物尿酸含量 的变化进行评价；样品对超氧阴离子（〇2_*)清除率可以通过HPLC-MS检测结果所显示的样 品能清除反应体系中超氧阴离子而导致的探针与超氧阴离子的特异性产物2-0H-E+生成量 的改变（减少）进行评价。 化合物对XOD抑制率或(V?的清除率按照以下公式计算： XOD抑制率或 02_ ?自由基清除率=[Ablank-AsampJAblankX100% 其中Ablank为对照组尿酸或2-0H-E+的峰面积值； Asample为样品组尿酸或2-0H-E+的峰面积值。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述样品为中药提取物或单体化合物。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述单体化合物是非布索坦、槲皮素、芹 菜素、丹酚酸C、维生素C、芦荟苷、芒柄花黄素或维生素E。
【专利摘要】本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种快速同时筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂和超氧阴离子清除剂的方法。该方法通过在待测化合物、底物、靶蛋白组成的反应体系中加入荧光探针，探针与超氧阴离子反应生成特异性产物2-OH-E+，在反应一段时间后，利用合适的方法终止反应，然后利用高效液相-质谱联用技术对反应体系中生成的尿酸和2-OH-E+进行定量分析，并对化合物的结构进行鉴定。通过检测与黄嘌呤氧化酶或超氧阴离子作用前与作用后尿酸和2-OH-E+含量的变化，分析天然产物提取物或单体化合物的黄嘌呤氧化酶抑制率或超氧阴离子清除率。
【IPC分类】G01N30-88
【公开号】CN104792910
【申请号】CN201510210024
【发明人】陈君, 张文, 付钰, 李萍, 莫华燕, 周萍, 董馨
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月28日