专利名称：一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法
技术领域：
本发明涉及一种叶片组织的原位显色和定量的方法，更具体的说是一种叶片组织 自由基测定的原位显色和定量的方法。
背景技术：
植物组织的光合作用、呼吸、氧化磷酸化、脂肪酸的-β_氧化以及许多氧化酶的代 谢过程均可产生活性氧自由基(统称为R0S)。愈来愈多的研究报道，ROS是植物体代谢的正 常部分，可作为信号分子诱导植物体对环境胁迫的应激响应，而过量ROS的积累却能诱导 膜脂质过氧化、蛋白分子的氧化修饰或降解，以及DNA分子的氧化损伤等。因此，研究自由 基的产生、积累和代谢的变化，能够反映植物体在逆境条件下的氧化胁迫和应激响应水平， 可为环境污染物的早期诊断提供预警信号。因此，准确测定植物组织ROS的产生和积累水 平具有十分重要的理论意义和应用前景。植物体内的ROS通常存在超氧阴离子自由基(02_ _)、过氧化氢(H2A )、羟基自由基 (0Η )、单线态氧(1O2)等类型，其中产生最早的是02__，氧化能力最强的是0Η。这些ROS类 型可以形成一个复杂的反应网络，通过协同作用相互转化。例如，02__和H2O2可通过!^nton 反应、Haber-Weiss反应、Winterbourn反应以及光解反应等过程转换成0H_。ROS的测定 方法通常包括分光光度法、原位显色法、自旋捕捉-电子顺磁共振法(ΕΗΟ、流式细胞仪测 定等方法。其中关于植物体(V—和H2O2的研究报道最多，也最受到关注。自由基的半衰期十分短暂，而且在植物体内的存在浓度很低，直接捕捉十分困难。 因此，人们常常应用间接方法去检测植物体内产生02__的速率。王爱国和罗广华[1]应用植 物勻浆液的羟胺反应产生O2 -的中间产物，再应用分光光度法测定和推算植物体内O2 -的 产生速率。Able AJ[2]应用四唑类化合物捕捉人工培养的烟草细胞内的0厂，应用分光光度 法测定O2 -中间产物的含量。这两种方法都是测定植物体产生O2 -速率的间接方法，被广 泛引用。植物组织的0厂也能够直接捕捉和定量。有研究报道，特异性捕获剂结合EPR-自 旋捕捉技术是检测生物和化学体系中02__产生量的最直接和最敏感的技术。02__的特异性 捕获剂phenyl-N-i-butylnitrone (PBN)能够与0厂迅速结合并形成稳定的中间产物，再 结合EPR-自旋捕捉技术就能够克服O2-存在周期短暂而不易捕捉的局限性，能够对02__进 行定性和定量分析 ]。然而这种方法所应用的设备十分昂贵，而且同一种捕获剂对不同的 植物也具有其特异性，因此，限制了推广。H2O2含量的测定主要应用分光光度法。1977年，Brerman T和Frenkel Cm建立 了应用TiCI4-分光光度法测定植物组织H2A的方法。之后，该方法被广泛用于测定植物组 织在生物或非生物胁迫下H2O2的水平变化。还有人应用过氧化物酶-Amplex Red (N-乙酰 基-3，7- 二羟基吩噁嗪)-分光光度法测定烟草细胞外H2A的变化[5]以及应用二甲氨基苯 甲酸、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐以及辣根过氧化物酶混合溶液，结合分光光度法 测定玉米幼苗组织H2A的含量[6]。上述方法中虽然应用到的化学反应试剂不同，但最终都应用分光光度法对中间产物进行测定。对植物叶片组织O2 -和H2A进行原位显色的研究也有报道，然而存在显色后如何 对自由基反应产物进行科学定量的问题，对植物叶片中O2 -和H2O2的准确定量成为了难以 解决的难题。
发明内容
、本发明要解决的技术问题
针对植物叶片中自由基(O2 -和H2O2)的分布和准确定量的难题，本发明提供了一种叶 片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，并应用Image-Pro plus软件对0厂和H2O2进 行定量分析，提高了对植物叶片自由基定量分析的准确性。、技术方案
一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，包含如下几个步骤 步骤(1)，叶片采集，清洗干净。剪取植物新鲜叶片，以幼嫩叶片为佳，用镊子夹住叶柄或叶片基部用纯水快速漂 洗干净，用滤纸吸干。步骤(2)，叶片自由基显色反应。设置空白对照组，根据所测自由基种类不同，显色反应前对对照组叶片作如下预 处理1)超氧阴离子自由基将叶片置于真空抽滤装置内，加入含1(T20 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2的pH值为6. 5 7. 5的磷酸缓冲溶液(PBS)，抽真空3次，每次3 5 min，效果以叶 片表面冒出明显气泡为宜；2)过氧化氢自由基将叶片置于真空抽滤装置内，加入含10 mM 抗坏血酸和广5 mM过氧化氢酶的pH值为6. 5 7. 5的PBS溶液，抽真空3次，每次3飞min。将预处理过的对照组叶片和未处理待测叶片置于真空抽滤装置内，根据所测自由 基种类不同，按如下处理1)超氧阴离子自由基立即应用含0. 5^1.0 mg/mL氮蓝四唑(NBT) 的PH值为6. 5^7. 5的PBS溶液抽真空3次，每次5 10 min ；2)过氧化氢取自由基立即应 用含广2 mg/mL 二氨基联苯胺(DAB)的pH值为6. 5 7. 5的PBS溶液抽真空3次，每次5 10 min。抽真空结束后，将叶片连同溶液置于暗处，静置5 12 h，使其充分显色。步骤(3)脱除叶片叶绿素，清洗叶片并扫描成像用于软件分析定量。显色反应结束后，用镊子将叶片从溶液中小心取出，洗去表面残余溶液，置于煮沸 的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注意防止暴沸，并注意在整个过程中补充因挥发 损失的乙醇溶液。加热时间随植株种类不同有所变化，一般以叶片组织完全失绿并变得透 明，可见自由基反应色斑时停止加热。叶片中的02__与NBT反应呈蓝色斑点，叶片中的H2A与 DAB反应呈棕褐色斑点。用纯水冲洗叶片后，扫描成像，应用图像处理软件Image-Pro plus 软件对自由基着色区域进行光密度统计分析。叶片可置于10%的甘油(ν/ν)中，4°C下长期 保存备用。、有益效果
本发明公开了一种一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，可以在植物叶 片上显示02__和H2A分布和定量，相比现有技术，具有以下明确的效果
(1)能够直观地显示叶片组织中O2 -和H2A的非均勻分布状况，有利于纠正对叶片自由 基均勻分布的错误观点。该方法特别适合于对植物幼苗叶片组织氧化胁迫的研究；(2)脱色后对自由基反应产生的色素沉淀区，应用计算机软件分析其其光密度，可实现 较为准确的半定量，有望在研究植物受氧化胁迫程度时得到广泛应用；
(3)成本低，操作简单，易推广。该方法所涉及的试剂和仪器都不昂贵，而且操作比较简 单，普通实验室基本都能够开展，因此容易推广。
图1是暴露于铅污染土壤的蚕豆幼苗叶片0厂原位显色示意图，其中(a)空白对 照组，(b) 500mg/kg外源铅处理组，(c) SOD酶预处理再显色的500mg/kg剂量组；
图2是暴露于铅污染土壤的蚕豆幼苗叶片02__的比色检测结果； 图3是暴露于镉污染土壤的水稻幼苗叶片02__的原位显色(A)和光密度分析结果(B); 图4铅污染土壤对蚕豆幼苗叶片H2A的诱导，其中A表示蚕豆叶片组织H2A的DAB原 位显色结果；B表示蚕豆叶片组织H2A的比色法检测结果。
具体实施例方式以下通过实例进一步说明本发明的实施应用
实施例1铅污染土壤暴露的蚕豆幼苗叶片组织O2-的积累水平和分布 选择蚕豆幼苗作为受试生物，应用NBT原位显色方法，研究了暴露于外源添加0，25， 125，250，500，1000, 2000 mg/kg铅污染土壤中的蚕豆幼苗叶片组织02__的积累水平和分布 状况。蚕豆种子播种一个月后，收集不同处理组和对照组植株的叶片，每一组均设置自由基 显色对照，处理如下将叶片置于真空抽滤装置内，加入含10 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2 的PH值为6. 5的磷酸缓冲溶液(PBS)，抽真空3次，每次3 min，真空度大小以能使叶片表 面冒出微小气泡为宜；将各组叶片连同自由基显色对照组叶片一起，置于含0. 5 mg/mL氮 蓝四唑(NBT)的pH值为6. 5的PBS溶液中，继续抽真空3次，每次约5 min，之后将叶片连 同溶液置于暗处，静置5 h，使其充分显色；显色反应结束后，用镊子将叶片从溶液中小心取 出，洗去表面残余溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注意防止暴沸， 煮沸至蚕豆叶片组织完全失绿并变得透明，可见明显蓝色色斑时停止加热。取出叶片，用纯 水冲洗干净，滤纸吸水，用扫描仪扫描成像，应用图像处理软件Image-Pro plus软件对蓝色 色斑进行光密度统计分析。图1是暴露于铅污染土壤的蚕豆幼苗叶片O2 -原位显色的示意图；图2是暴露于 铅污染土壤的蚕豆幼苗叶片02__的比色检测结果。实验结果表明，蚕豆种子播种一个月后， 叶片ο厂的灰质度显著性增加，而将铅处理组的叶片应用SOD酶预处理后再进行原位显色， 0厂灰质度明显减少。实验结果证明，铅污染土壤能够诱导蚕豆幼苗叶片组织0厂的积累， 而且02__在叶片中的分布是非均勻的(见图1)。实验同步采用比色法对叶片中02__含量进 行了分析，发现软件统计结果与比色法检测结果基本一致(图2)。实施例2镉污染土壤诱导水稻幼苗叶片组织02__的积累和分布
选择水稻幼苗作为受试生物，应用NBT原位显色方法，研究了暴露于镉污染土壤一个 月后的水稻幼苗叶片组织02__的积累水平和分布状况，土壤镉含量采用原子吸收光谱法测 定。暴露一个月后，收集不同处理组和对照组水稻的叶片，每一组均设置自由基显色对照， 处理如下将叶片置于真空抽滤装置内，加入含20 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2的pH值为7. 0的磷酸缓冲溶液(PBS)，抽真空3次，每次5 min，真空度大小以能使叶片表面冒出微小 气泡为宜；将各组叶片连同自由基显色对照组叶片一起，置于含1 mg/mL氮蓝四唑(NBT)的 PH值为7. 0的PBS溶液中，继续抽真空3次，每次约10 min,之后将叶片连同溶液置于暗处， 静置8 h，使其充分显色；显色反应结束后，用镊子将叶片从溶液中小心取出，洗去表面残余 溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，至水稻叶片组织完全失绿并变得透明，可见明 显蓝色色斑时停止加热。取出叶片，用纯水冲洗干净，滤纸吸水，用扫描仪扫描成像，应用图 像处理软件Image-Pro plus软件对蓝色色斑进行光密度统计分析。图3 (A)是暴露于镉污染土壤的水稻幼苗叶片0厂原位显色的示意图；图3 (B) 是暴露于镉污染土壤的水稻幼苗叶片02__的光密度软件分析结果。实验结果表明，暴露一 个月后，镉污染土壤显著诱导了水稻0厂的积累，而且其光密度值随着外源镉浓度的增加而 呈现增大趋势。实施例3铅污染土壤诱导蚕豆幼苗叶片组织H2A的积累和分布
选择蚕豆幼苗作为受试生物，应用DAB原位显色方法，研究了暴露于外源添加0，25， 125，250，500，1000, 2000 mg/kg铅污染土壤中的蚕豆幼苗叶片组织H2A的积累水平和分布 状况。蚕豆种子播种一个月后，收集不同处理组和对照组植株的叶片，每一组均设置自由基 显色对照，处理如下将叶片置于真空抽滤装置内，加入含10 mM抗坏血酸和1 mM过氧化 氢酶的PH值为7. 5的磷酸缓冲溶液(PBS)，抽真空3次，每次5 min，真空度大小以能使叶片 表面冒出微小气泡为宜；将各组叶片连同自由基显色对照组叶片一起，置于含1 mg/mL 二 氨基联苯胺(DAB)的pH值为7. 5的PBS溶液中，继续抽真空3次，每次约8 min，之后将叶 片连同溶液置于暗处，静置12 h，使其充分显色；显色反应结束后，用镊子将叶片从溶液中 小心取出，洗去表面残余溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注意防 止暴沸，至蚕豆叶片组织完全失绿并变得透明，可见明显棕褐色色素沉淀时停止加热。取出 叶片，用纯水冲洗干净，滤纸吸水，用扫描仪扫描成像，应用图像处理软件Image-Pro plus 软件对蓝色色斑进行光密度统计分析。实验还同步采用比色法对叶片中H2O2含量进行了检 测。图4A是暴露于铅污染土壤的蚕豆幼苗叶片H2A原位显色的示意图；图4B是暴露 于铅污染土壤的蚕豆幼苗叶片H2A的比色检测结果。实验结果表明，蚕豆种子播种一个月 后，铅污染土壤能够诱导蚕豆幼苗叶片组织H2A的积累，而且其分布是非均勻性的，其光密 度的变化与分光光度法检测结果基本一致。
权利要求
1.一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，其步骤为第一步采集植物新鲜叶片，快速漂洗干净；第二步叶片自由基显色反应；第三步脱除叶片叶绿素，清洗叶片并扫描成像用于软件分析定量。
2.根据权利要求1所述的一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，其特征 在于同步设置对照组，根据所测自由基种类不同，在第二步前对对照组叶片前处理方法分 别为1)超氧阴离子自由基将叶片置于真空抽滤装置内，加入含1(T20 U/mL SOD酶和10 mM MnCl2W溶液，抽真空3次，每次;Γ5 min，效果以叶片表面冒出明显气泡为宜；2)过氧化 氢自由基将叶片置于真空抽滤装置内，加入含10 mM抗坏血酸和广2 mM过氧化氢酶的溶 液，抽真空3次，每次3 5min，效果以叶片表面冒出明显气泡为宜。
3.根据权利要求1或2所述的一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法， 其特征在于第二步具体为将预处理过的对照组叶片和未处理待测叶片置于真空抽滤装置 内，根据所测自由基种类不同，按如下处理1)超氧阴离子自由基应用0. 5^1. 0 mg/mL氮蓝 四唑NBT溶液抽真空3次，每次5 10 min ；2)过氧化氢取自由基立即应用广2 mg/mL 二氨 基联苯胺DAB溶液抽真空3次，每次5 10 min ；抽滤结束后，将叶片连同溶液置于暗处，静 置5 12 h，使其充分显色。
4.根据权利要求3中任一项所述的一种叶片组织超氧阴离子和过氧化氢自由基测定 的原位显色和定量的方法，其特征在于第三步具体为显色反应结束后，用镊子将叶片从溶 液中小心取出，洗去表面残余溶液，置于煮沸的80%的乙醇溶液(ν/ν)中，溶液加入沸石注 意防止暴沸，并注意在整个过程中补充因挥发损失的乙醇溶液；以叶片组织完全失绿并变 得透明，可见自由基反应色斑时停止加热；叶片超氧阴离子自由基与NBT反应呈蓝色斑点， 过氧化氢自由基与DAB反应呈棕褐色斑点；用纯水冲洗叶片后，扫描成像，应用图像处理软 件Image-Pro plus软件对自由基着色区域进行光密度统计分析；叶片可置于10%的甘油 (ν/ν)中，4°C下长期保存备用。
5.根据权利要求3中任一项所述的一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方 法，其特征在于对照组预处理所用的溶液以及显色反应所用的NBT和DAB溶液均用10 mM 磷酸缓冲溶液PBS配制，pH值保持在6. 5^7. 5。
全文摘要
本发明公开了一种叶片组织自由基测定的原位显色和定量的方法，属于叶片自由基测定领域。其步骤为第一步采集植物新鲜叶片，快速漂洗干净；第二步叶片自由基显色反应，1)超氧阴离子自由基将叶片置于真空抽滤装置内，加入含SOD酶和MnCl2的溶液，抽真空，效果以叶片表面冒出明显气泡为宜；2)过氧化氢自由基将叶片置于真空抽滤装置内，加入含抗坏血酸和mm过氧化氢酶的溶液，抽真空，效果以叶片表面冒出明显气泡为宜。第三步脱除叶片叶绿素，清洗叶片并扫描成像用于软件分析定量。本发明能够直观地显示叶片组织中O2.-和H2O2的非均匀分布状况，可实现较为准确的半定量，成本低，操作简单，易推广。
文档编号G01N21/27GK102147359SQ20111000024
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月4日 优先权日2011年1月4日
发明者姜锦林, 汪承润, 王晓蓉, 田园, 耿金菊, 顾雪元 申请人:南京大学