专利名称：一种羟基柠檬酸的含量测定方法
技术领域：
本发明涉及羟基柠檬酸的含量测定方法，尤其涉及印度果皮精提取物及其制品中羟基柠檬酸的含量测定方法。
背景技术：
印度果皮精提取物(Garcinia Extracts)是用原产于印度和东南亚的Garcinia Cambogia果实(在印度还被称为Goraka、Tamarind、Malabar等等)的干燥果皮，经加热提取羟基柠檬酸(Hydroxycitric Acid，HCA)，浓缩精制而成。根据国外的许多研究表明羟基柠檬酸对ATP柠檬酸裂合酶有阻滞作用。羟基柠檬酸对ATP柠檬酸裂合酶的亲合力，比柠檬酸强100倍。羟基柠檬酸在达到一定浓度时，可进入肝细胞内，阻碍ATP柠檬酸裂合酶的活性，从而抑制脂肪的合成，达到减肥的功效。印度果皮精提取物中主要含有羟基柠檬酸和其它有机酸，其中羟基柠檬酸以游离酸和内酯体两种形式存在，这两种存在形式均有减肥功效，因此，印度果皮精提取物常应用于减肥食品中，如减肥茶、减肥饮料等等。
有文献报道用高效液相色谱法直接测定印度果皮精提取物中羟基柠檬酸及其内酯体，但该法测定减肥咖啡中羟基柠檬酸含量时，干扰峰较多，干扰峰和羟基柠檬酸及其内酯体的分离度很差，不能进行精确的含量测定；另外，羟基柠檬酸及其内酯体均为有效成分，而羟基柠檬酸内酯体对照品又不易购得，分别测定羟基柠檬酸及其内酯体难度也较大，有必要探索出杂质干扰少而更加精确的羟基柠檬酸含量测定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂质干扰少、精确度高的羟基柠檬酸含量测定方法。该方法可精确测定印度果皮精提取物及其制品中羟基柠檬酸的含量。
本发明方法可以通过下列措施来实现待测样品先用强碱溶液加热处理，然后再用强酸溶液对其进行中和，用溶剂定容至一定体积，制成供试品溶液；羟基柠檬酸或羟基柠檬酸盐用溶剂配制成对照品溶液；分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
上述待测样品为印度果皮精提取物，或者为以印度果皮精提取物为活性成分制成的各种制品如减肥咖啡、减肥茶、减肥饮料等。
上述用强碱溶液加热处理中的强碱为无机碱，最佳为氢氧化钠或氢氧化钾溶液；上述用强酸溶液对其进行中和中的强酸为无机酸，最佳为硫酸或高氯酸溶液。上述溶剂为水或流动相溶液。
上述高效液相色谱测定的条件十八烷基键合硅胶为固定相，含水量90％以上的酸性溶液为流动相。所述含水量90％以上的酸性溶液为水或者水-甲醇或者水-乙腈，用酸如甲酸、冰乙酸、磷酸、盐酸、硫酸、高氯酸等将其调节至pH 1～6。所述含水量90％以上的酸性溶液最佳为水，或者水-甲醇＝99∶1，或者水-乙腈＝99∶1，用酸如甲酸、冰乙酸、磷酸、盐酸、硫酸、高氯酸等将其调节至pH 1～6。，上述检测波长为200～220nm，最佳为210nm。
本发明先采用强碱对印度果皮精提取物及其制品进行碱水解，使羟基柠檬酸中的游离酸和内酯体两种形式均转化成游离酸的形式，且其它干扰峰在用强碱溶液加热处理时遭到破坏，从而消除了干扰峰的干扰，然后用强酸中和过剩的碱液，用高效液相色仪进行测定。本发明方法不仅准确度高、专属性强，能很好地将羟基柠檬酸与其它杂质峰分开，从而能准确地测定羟基柠檬酸的含量，而且适用性广，可广泛应用于印度果皮精提取物及其制品的含量测定。
图1为本发明方法之印度果皮精提取物在210nm处含量测定色谱2为本发明方法之羟基柠檬酸对照品在210nm处含量测定色谱3为对比例之印度果皮精提取物在210nm处含量测定色谱4为对比例之羟基柠檬酸对照品在210nm处含量测定色谱5为本发明方法之减肥咖啡在200nm处含量测定色谱6为本发明方法之减肥咖啡在220nm处含量测定色谱7为本发明方法之减肥咖啡在210nm处含量测定色谱图具体实施方式
下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
实施例一色谱条件与系统适应性 色谱柱用Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相用6mmol/l的硫酸水溶液；流速为0.8ml/min；紫外检测波长为210nm；柱温为30℃；理论塔板数按羟基柠檬酸峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取羟基柠檬酸对照品12mg，置25ml量瓶中，加适量流动相使溶解，再加流动相至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密称取印度果皮精提取物100mg(北京莱福赛茵生物工程技术有限公司提供)，置100ml圆底烧瓶中，加入0.1mol/l的氢氧化钾50ml，沸水浴加热30分钟，冷却至室温，加入1mol/l的高氯酸溶液5ml，摇匀，将此液体转移至100ml量瓶中，圆底烧瓶用水洗涤3次，每次10ml，洗液并入量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定。
结果 该印度果皮精提取物的羟基柠檬酸含量为55.74％。供试品色谱图见图1，对照品色谱图见图2。
对比例色谱条件与系统适应性 色谱柱用Agilent Zorbax SB-Aq柱(4.6×250mm，5μm)；流动相用6mmol/l的硫酸水溶液；流速为0.5ml/min；紫外检测波长为210nm；柱温为30℃；理论塔板数按羟基柠檬酸峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取羟基柠檬酸对照品15mg，置25ml量瓶中，加适量流动相使溶解，再加流动相至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密称取印度果皮精提取物100mg(北京莱福赛茵生物工程技术有限公司提供)，置100ml圆底烧瓶中，加流动相适量，超声使溶散，再用流动相定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定。
结果 由图3和图4可见，在此条件下，供试品色谱图杂质峰较多，且严重干扰羟基柠檬酸的测定，不能满足定量分析的要求。
实施例二色谱条件与系统适应性 色谱柱用Agilent Zorbax SB-Aq柱(4.6×250mm，5μm)；流动相用6mmol/l的磷酸水溶液；流速为0.8ml/min；紫外检测波长为220nm；柱温为30℃；理论塔板数按羟基柠檬酸峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取羟基柠檬酸钙对照品15mg，置25ml量瓶中，加适量流动相使溶解，再加流动相至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密称取印度果皮精提取物100mg(北京莱福赛茵生物工程技术有限公司提供)，置100ml圆底烧瓶中，加入0.1mol/l的氢氧化钠50ml，沸水浴加热30分钟，冷却至室温，加入1mol/l的硫酸溶液5ml，摇匀，将此液体转移至100ml量瓶中，圆底烧瓶用水洗涤3次，每次10ml，洗液并入量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液10ul，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定(以1mg羟基柠檬酸钙相当于0.7847mg羟基柠檬酸计算)。
结果 该印度果皮精提取物的羟基柠檬酸含量为55.24％。
实施例三色谱条件与系统适应性 色谱柱用Agilent Zorbax SB-Aq柱(4.6×250mm，5μm)；流动相用7mmol/l的磷酸水溶液；流速为0.8ml/min；紫外检测波长为200nm；柱温为30℃；理论塔板数按羟基柠檬酸峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取羟基柠檬酸钙对照品15mg，置25ml量瓶中，加适量流动相使溶解，再加流动相至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密称取减肥咖啡300mg(天津金士力保健品有限公司提供，由速溶咖啡、印度果皮精提取物等组成)，置100ml圆底烧瓶中，加入0.1mol/l的氢氧化钠50ml，沸水浴加热30分钟，冷却至室温，加入1mol/l的硫酸溶液5ml，摇匀，将此液体转移至100ml量瓶中，圆底烧瓶用水洗涤3次，每次10ml，洗液并入量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定(以1mg羟基柠檬酸钙相当于0.7847mg羟基柠檬酸计算)。
结果 该减肥咖啡的羟基柠檬酸含量为16.51％。供试品色谱图见图5。
实施例四色谱条件与系统适应性 色谱柱用Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相用6mmol/l的硫酸水溶液；流速为0.8ml/min；紫外检测波长为220nm；柱温为30℃；理论塔板数按羟基柠檬酸峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取羟基柠檬酸对照品12mg，置25ml量瓶中，加适量流动相使溶解，再加流动相至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密称取减肥咖啡300mg(天津金士力保健品有限公司提供，由速溶咖啡、印度果皮精提取物等组成)，置100ml圆底烧瓶中，加入0.1mol/l的氢氧化钾50ml，沸水浴加热30分钟，冷却至室温，加入1mol/l的高氯酸溶液5ml，摇匀，将此液体转移至100ml量瓶中，圆底烧瓶用水洗涤3次，每次10ml，洗液并入量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定。
结果 该减肥咖啡的羟基柠檬酸含量为15.75％。供试品色谱图见图6。
实施例五色谱条件与系统适应性 色谱柱用Waters μ-BondapackTM C18柱(4.6×250mm，5μm)；流动相用6mmol/l的高氯酸水溶液；流速为0.8ml/min；紫外检测波长为210nm；柱温为30℃；理论塔板数按羟基柠檬酸峰计算，应不低于2000。
对照品溶液的制备 精密称取羟基柠檬酸钙对照品15mg，置25ml量瓶中，加适量流动相使溶解，再加流动相至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液的制备 精密称取减肥咖啡150mg(天津金士力保健品有限公司提供，由速溶咖啡、印度果皮精提取物等组成)，置100ml圆底烧瓶中，加入0.1mol/l的氢氧化钠50ml，沸水浴加热30分钟，冷却至室温，加入1mol/l的高氯酸溶液5ml，摇匀，将此液体转移至100ml量瓶中，圆底烧瓶用水洗涤3次，每次10ml，洗液并入量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl，供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定(以1mg羟基柠檬酸钙相当于0.7847mg羟基柠檬酸计算)。
结果 该减肥咖啡的羟基柠檬酸含量为14.73％。供试品色谱图见图7。
权利要求
1.一种羟基柠檬酸的含量测定方法，包括将待测样品制成供试品溶液，羟基柠檬酸或羟基柠檬酸盐配制成对照品溶液，然后分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，其特征在于所述待测样品制成供试品溶液为待测样品先用强碱溶液加热处理，然后再用强酸溶液对其进行中和，用溶剂定容至一定体积，制成供试品溶液。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述强碱为无机碱，所述强酸为无机酸。
3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾溶液，所述强酸为硫酸或高氯酸溶液，所述溶剂为水或流动相溶液。
4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱测定的条件为十八烷基键合硅胶为固定相，含水量90％以上的酸性溶液为流动相，检测波长为200～220nm。
5.根据权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于，所述流动相为水，或者水-甲醇，或者水-乙腈，再用酸将其调节至pH 1～6。
6.根据权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于，所述流动相为水，或者水-甲醇＝99∶1，或者水-乙腈＝99∶1，用甲酸、冰乙酸、磷酸、盐酸、硫酸或高氯酸将其调节至pH1～6。
7.根据权利要求4所述的含量测定方法，其特征在于，所述检测波长为210nm。
8.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，待测样品先用氢氧化钠或氢氧化钾溶液加热处理，然后再用硫酸或高氯酸溶液对其进行中和，用水定容至一定体积，制成供试品溶液；羟基柠檬酸或羟基柠檬酸盐用流动相配制成对照品溶液；高效液相色谱测定的条件为十八烷基键合硅胶为固定相，6～7mmol/l的磷酸水溶液或者硫酸水溶液或者高氯酸水溶液为流动相，检测波长为210nm。
9.根据权利要求1～8任一权利要求所述的含量测定方法，其特征在于，所述待测样品为印度果皮精提取物。
10.根据权利要求1～8任一权利要求所述的含量测定方法，其特征在于，所述待测样品为以印度果皮精提取物为活性成分制成的各种制品。
全文摘要
本发明公开了一种羟基柠檬酸的含量测定方法，它是将待测样品先用强碱溶液加热处理，然后再用强酸溶液对其进行中和，用溶剂定容至一定体积，制成供试品溶液；羟基柠檬酸或羟基柠檬酸盐配制成对照品溶液；然后分别吸取对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本发明方法能准确地测定羟基柠檬酸的含量，可广泛应用于印度果皮精提取物及其制品的含量测定。
文档编号G01N30/88GK1924572SQ20051001496
公开日2007年3月7日 申请日期2005年9月1日 优先权日2005年9月1日
发明者李伟, 高钧, 魏峰, 李旭 申请人:天津天士力制药股份有限公司