专利名称：用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA的LSPR传感芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于肿瘤细胞中质粒DNA含量的检测技术领域，涉及一种用于检测含致癌 基因C-myc抗原片段的质粒DNA的传感芯片及其方法。
背景技术：
C-myc是一种原癌基因，在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及细胞周期的进程中起 重要作用。由C-myc基因编码的C-myc重组蛋白不仅在细胞生命活动如细胞增殖、细胞分 化和细胞周期中有极其重要的作用，而且还密切地参与了细胞肿瘤的转化。C-myc重组蛋白 的表达与很多癌组织和细胞肿瘤的启动及癌性程度密切相关。目前针对质粒DNA的检测方法分别有水平琼脂糖凝胶电泳法和传统的染色体免 疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)方法，并没有专门针对含致癌基因 C-myc抗原片段的质粒DNA的检测方法。上述方法操作繁琐、精度低，仅能做到定性或半定 量，且抗干扰性、选择性不足，使其应用受到限制。因此需要寻找一种能够快速定量地检测 含C-myc抗原片段的质粒DNA的方法。本发明提供了一种基于金纳米粒子的局域表面等离 子体共振(LSPR)光谱技术的生物传感检测芯片及其方法，能简便、快速、定量地检测癌变 组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA检 测用的Lsra传感芯片及其方法，其特征在于利用基于金纳米粒子表面产生的局域表面等 离子体共振光谱技术实现快速、简便、定量地检测癌变组织中含C-myc碱基序列的质粒DNA 的含量，即所述LSra传感芯片的检测方法是通过固定于传感芯片上的C-myc单克隆抗体与 含C-myc抗原片段的质粒DNA的免疫反应结合，引起芯片上金纳米粒子表面产生局域表面 等离子体共振光谱吸收峰的位移，与含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量成线性响应关系 而达到检测目的。为解决上述问题，本发明采用如下技术方案采用磁控溅射镀膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃表面镀上一层金膜(30 300nm)，通过控制镀膜真空度< 1. OX 10_3Pa，镀膜速度幻.0 A/s，使所述金膜表面平整光滑， 形成金平板电极。然后将Piranha溶液(注=Piranha溶液为浓硫酸双氧水=7 3的溶 液)滴加在金平板电极金膜表面浸润5 30s，取出用二次蒸馏水反复冲洗3次处理后，将 上述电极依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声5 600s。然后将上述电极浸入10 200mmol/L的1，4_ 二硫苏糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 Mh，可在金膜表面组装上一 层DTT单分子膜层。分别用无水乙醇、二次蒸馏水反复冲洗后，将上述电极浸入纳米金溶胶 溶液(粒径大小为5 50nm)中放置1 Mh，这样金纳米粒子可通过Au-S键固定在金平 板电极金膜表面形成金纳米粒子层，用二次蒸馏水反复冲洗干净，并保存于二次蒸馏水中
将上述电极浸入0. 1 lOOmmol/L的3_巯基丙酸中，静置1 Mh，可在金纳米 粒子层表面修饰上3-巯基丙酸单分子层；用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加1 200mmol/ L DMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP为4- 二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基_ (3- 二甲基氨基 丙基)碳二亚胺)于电极上活化1 30min，再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净。经 过DMAP-EDC活化，在上述电极上滴加0 2. 6 μ g/mL C-myc单克隆抗体水溶液，反应3 600min后，使3-巯基丙酸与C-myc单克隆抗体键合，C-myc单克隆抗体的吸附量范围为 0. 01 0. 4g-mr1 ·πιπΓ2 ；再用二次蒸馏水冲洗干净，保存于4°C环境中备用，即得C-myc单 克隆抗体修饰的Lsra传感芯片。当入射光照射传感芯片，入射光子频率与金纳米粒子上的自由电子的集体振动 发生共振时，导致金纳米粒子表面的局部电场被增强，反射光能量增强，从而展现出强烈 的表面等离子体吸收，其局域表面等离子体共振光谱的吸收峰范围在200 700nm之 间。当C-myc单克隆抗体与含C-myc抗原片段的质粒DNA结合后，等离子体共振频率变 小，共振吸收峰向长波方向移动，该峰位移与待测含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量在 9. OX IO"3 μ g/mL 1. 5 μ g/mL范围内成线性响应关系，检测下限达到9. Ong/mL，可实现在 线动态监测、快速定量检测含C-myc抗原片段的质粒DNA分子的目的。同时，所述LSTO传 感芯片对癌变组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量能进行准确测定，其回收率为 91. 11% 112. 00%，在癌症疾病预测和治疗等生物医学方面具有非常重要的应用前景和 经济价值。本发明的有益效果是，该LSra传感芯片与传统的染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法相比，灵敏度高，选择性和重现性好，且具有组装简便、定 量快速、可实现多通道检测等优点。
图ι是LSra传感芯片敏感膜结构示意图。图2是基于金纳米粒子的局域表面等离子体共振光谱检测示意图。图3是传感芯片的局域表面等离子共振吸收峰位移与含c-myc抗原片段的质粒 DNA浓度的对应关系曲线图，其在9. 0 X 10_3 μ g/mL 1. 5 μ g/mL范围的标准曲线(见图3 内插图)方程为Δ λ = 0. 00948+1. 38723C其中Δ λ表示为最大吸收峰位移值(nm)，C表示含Ciyc抗原片段的质粒DNA的 浓度(μ g/mL)。上述关系曲线是在室温25°C时绘制的。图4是典型质粒DNA的pCMV-myc片段碱基序列图。图5是典型金纳米粒子的TEM图。图1、2中，1.厚度均勻的金膜，2. DTT自组装单分子层，3.金纳米粒子层，4.3-巯 基丙酸单分子层，5. C-myc单克隆抗体，6.含C-myc抗原片段的质粒DNA。
具体实施例方式实施例1
LSPR传感芯片的组装制备1)采用磁控溅射镀膜法在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面镀上一层IOOnm 的金膜，通过控制镀膜真空度为1. O X IO-4Pa,镀膜速度为1.0 A/s,使所述金膜表面平整光 滑，形成金平板电极；2)将Piranha溶液(注=Piranha溶液为浓硫酸双氧水=7 3的溶液)滴加 在金平板电极表面浸润15s，取出后用二次蒸馏水反复冲洗3次；3)将上述电极依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声60s ；4)将上述电极浸入50mmol/L的DTT溶液中，放置10h，形成DTT单分子层，用无水 乙醇反复冲洗3次以去除表面游离的DTT，再用二次蒸馏水反复冲洗干净；5)将上述电极浸入粒径为10. 5nm的纳米金溶胶中，放置Mh，取出后用二次蒸馏 水反复冲洗干净，这样金纳米粒子通过Au-S键固定在金平板电极金膜表面形成金纳米粒 子层，然后保存于二次蒸馏水中备用；6)将上述电极浸入lOmmol/L的3-巯基丙酸中，静置他，在金纳米粒子上形成
3-巯基丙酸单分子层，然后用二次蒸馏水冲洗干净；7)用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加lOOmmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP为
4-二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)于电极上活化lOmin， 再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；8)在上述电极上滴加2. 4μ g/mL C_myC单克隆抗体水溶液，反应60min后，再用二 次蒸馏水冲洗干净，保存于4°C环境中备用，即制得用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的 质粒DNA的C-myc单克隆抗体修饰的LSI3R传感芯片。实施例2含C-myc抗原片段的质粒DNA标准曲线的测定1)所用试剂(二次蒸馏水、PBS缓冲溶液)经灭菌处理后均保存于4°C环境中备 用；2)取1 μ L质粒DNA置于1. 5mL小试管中，以PBS为缓冲溶液，分别稀释1 100000 倍，配制成0 1. 5 μ g/mL的一系列溶液备用；3)采用上述C-myc单克隆抗体修饰的LSI3R传感芯片分别测试各浓度的质粒DNA 样品，通过C-myc单克隆抗体与含C-myc抗原片段的质粒DNA的免疫反应结合，引起芯片上 金纳米粒子局域表面等离子体共振光谱吸收峰红移，该峰位移与质粒DNA含量成线性响应 关系；以质粒DNA的浓度C( μ g/mL)为横坐标，最大吸收峰位移值Δ λ (nm)为纵坐标，绘制 测定质粒DNA样品浓度的标准曲线(见图3内插图)，通过质粒DNA对应浓度的LSI3R吸收 峰位移信号，即可测定出癌变组织样品中的含C-myc抗原片段的质粒DNA的含量；4)测试完后，用0. lmol/L HCl溶液洗脱回复，再分别用PBS缓冲溶液、二次蒸馏水 冲洗干净，可保存于4°C环境中备用。实施例3大肠杆菌中含C-myc抗原片段的质粒DNA浓度的测定本实施例采用碱裂解法提取大肠杆菌中含C-myc抗原片段的质粒DNA，具体操作 方法如下1、取含质粒的大肠杆菌细胞于aiil LB培养基，37°C振荡培养过夜，取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。2、力口 0. Iml 溶液 I (1 %葡萄糖，50mM/L EDTA ρΗ8· 0,25mM/L Tris-HCl ρΗ8· 0)充 分混合。加入0. 2ml溶液II (0. 2mM/L NaOH, 1 % SDS)，轻轻翻转混勻，置于冰浴5min。加入 0. 15ml预冷溶液III (5mol/L KAc, ρΗ4· 8)，轻轻翻转混勻，置于冰浴5min。3、以IOOOrpm离心20min，取上清液于另一新Ep管，再加入等体积的异戊醇，混勻 后于0°C静置lOmin，再以IOOOrpm离心20min，弃上清，用70 %乙醇0. 5ml洗涤一次，抽干 所有液体，待沉淀干燥后，溶于0. 05mlTE缓冲液中。4、将上述处理好的质粒DNA待测液滴在传感芯片表面反应Imin后用二次蒸馏水 冲洗。再次记录读数。每个吸收峰响应值(Δ λ，nm)可由下式得出Δ λ = λ 1-λ2，把 Δ λ代入到图3的标准曲线方程中，即可算出待测液中含C-myc抗原片段的质粒DNA的浓 度值，检测结果表明该传感芯片检测技术可以用于质粒DNA含量快速、准确的检测。实施例4回收率的测定本实施例测定质粒DNA传感芯片对响应不同浓度质粒DNA溶液的回收率，并与传 统生物学上的染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)方法进行比较。 在已知浓度溶液中加入已知量的含C-myc抗原片段的质粒DNA样品溶液(300ng/mL、500ng/ mL和1800ng/mL)，然后测定各样品的吸收峰，计算位移值Δ λ，对照工作曲线找出浓度，比 较测得的加入量和实际加入量，获得的回收率分别为93. 33%U06. 00%和101. 67%，平均 回收率为100. 33%，而ChIP方法仅能做出定性检测，说明本发明方法优于ChIP法，且回收 率好，在含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA检测方面具有实际应用价值。实施例5重现性的测定在上述的传感芯片上，固定C-myc单克隆抗体的传感膜对响应不同浓度的质粒 DNA溶液的出峰位置的重现性，本实施例测定LSra传感芯片对响应不同浓度含c-myc抗原片段的质粒DNA溶液 的吸收峰位置的重现性，对0.6 μ g/mL和1.5yg/mL样品重复测定12次，通过对数据的分 析处理，获得的相对标准偏差分别为3. 70%和1.08%，说明该方法有着良好的重现性，确 保了所测实验数据的准确性。
权利要求
1.一种用于检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的LSTO传感芯片，其特征 在于利用金纳米粒子表面产生的局域表面等离子体共振(LSPR)光谱对含C-myc抗原片段 的质粒DNA(6)的含量进行测定。
2.根据权利要求1所述的LSI^R传感芯片，其特征在于所述LSI^R传感芯片的制备过程 如下1)采用磁控溅射镀膜法，在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃基质表面镀上一层金膜(1)， 通过控制镀膜真空度彡1.0\10_^!，镀膜速度幻.0人/5，使所述金膜(1)表面平整光滑，形 成金平板电极；2)将Piranha溶液(注=Piranha溶液为浓硫酸双氧水=7 3的溶液)滴加在金 平板电极金膜(1)表面浸润5 30s，取出后用二次蒸馏水反复冲洗3次；3)将上述电极依次浸泡在无水乙醇和二次蒸馏水中超声5 600s；4)将上述电极浸入10 200mmol/L的1，4-二硫苏糖醇(DTT)/乙醇溶液中，放置1 Mh，形成DTT单分子层O)，用无水乙醇反复冲洗3次以去除表面游离的DTT，再用二次蒸 馏水反复冲洗干净；5)将上述电极浸入纳米金溶胶溶液中，放置1 Mh，取出后用二次蒸馏水反复冲洗干 净，这样金纳米粒子通过Au-S键固定在金平板电极金膜(1)表面形成金纳米粒子层(3)，然 后保存于二次蒸馏水中备用；6)将上述电极浸入0.1 lOOmmol/L的3-巯基丙酸中，静置1 Mh，在金纳米粒子 层( 上形成3-巯基丙酸单分子层；7)用二次蒸馏水反复冲洗后，滴加1 200mmol/LDMAP-EDC的乙醇溶液(注DMAP 为4-二甲氨基吡啶，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)于电极上活化1 30min，再分别用乙醇、二次蒸馏水反复冲洗干净；8)在上述电极上滴加0 2.6 μ g/mL C-myc单克隆抗体水溶液，反应3 600min后， 再用二次蒸馏水冲洗干净，保存于4°C环境中备用，即得C-myc单克隆抗体(5)修饰的LSI5R 传感芯片。
3.根据权利要求ι所述的Lsra传感芯片，其特征在于所述LSra传感芯片的检测方法 是通过固定于传感芯片上的C-myc单克隆抗体(5)与含C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的 免疫反应结合，引起芯片上金纳米粒子层(3)表面产生局域表面等离子体共振光谱吸收峰 的位移，与含C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的含量成线性响应关系。
4.根据权利要求2所述的Lsra传感芯片，其特征在于在聚苯乙烯塑料、硅氧化物玻璃 基质表面所镀金膜(1)的厚度控制为30 300nm之间。
5.根据权利要求2所述的Lsra传感芯片，其特征在于所述金溶胶溶液中金纳米粒子的 粒径大小在5 50nm之间。
6.根据权利要求2所述的LSra传感芯片，其特征在于固定于LSra传感芯片上的C-myc 单克隆抗体(5)的吸附量在0. 01 0. 4g · mL—1 · mm 2之间。
7.根据权利要求3所述的LSI^R传感芯片，其特征在于所述LSI^R传感芯片上金纳米粒 子层(3)表面所展现的局域表面等离子体共振光谱的吸收峰范围在200 700nm之间。
8.根据权利要求3所述的Lsra传感芯片，其特征在于所述Lsra传感芯片对癌变 组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的含量能进行准确测定，其回收率为91. 11% ·112. 00%，线性范围为 9. 0Χ10_3μ g/mL 1. 5 μ g/mL，检测下限达到 9. Ong/mL。
全文摘要
本发明提供了一种基于局域表面等离子体共振(LSPR)光谱检测含致癌基因C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的LSPR传感芯片。本发明是在LSPR传感芯片的金膜(1)表面组装上一层DTT单分子层(2)，接上金纳米粒子层(3)，在所述金纳米粒子层(3)表面修饰上3-巯基丙酸单分子层(4)，然后通过DMAP-EDC活化，使所述的3-巯基丙酸单分子层(4)与C-myc单克隆抗体(5)结合，通过C-myc单克隆抗体(5)与含C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的免疫反应结合，引起金纳米粒子表面产生局域表面等离子体共振吸收峰的位移，以此来检测癌变组织中含C-myc抗原片段的质粒DNA(6)的含量。本发明的效果和益处在于所述LSPR传感芯片具有组装简便、定量快速、可实现多通道检测，且灵敏度高、选择性和重现性好，优于传统的染色体免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法。
文档编号G01N33/577GK102081095SQ201110000088
公开日2011年6月1日 申请日期2011年1月4日 优先权日2011年1月4日
发明者何婧琳, 孙立贤, 张玲, 戴云林, 曹忠, 曾巨澜, 王明星, 黄茜茜 申请人:长沙理工大学