一种筛选超氧阴离子清除剂的方法
【专利摘要】本发明提供了一种筛选超氧阴离子清除剂的方法。解决现有技术中筛选超氧阴离子清除剂的方法存在检测困难，准确度低，重现性差的技术问题。本方法是选用邻苯三酚碱性自氧化体系，结合紫外-可见分光光度法对超氧阴离子清除剂的清除作用进行评价，通过检测与超氧阴离子作用后捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜吸光度的变化计算出清除剂对超氧阴离子的清除率。本方法可用于分析天然产物提取物或单体对超氧阴离子体外清除率，具有重现性好，准确度高，操作简便的优点。
【专利说明】一种筛选超氧阴离子清除剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学领域，具体涉及一种筛选超氧阴离子清除剂的方法。
【背景技术】
[0002]活性氧包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等，这些粒子均十分微小。由于存在未配对的自由电子，活性氧的化学性质十分活跃。活性氧往往是生物生化过程中的一种副产品，当其过量时，机体内的活性氧会对细胞和基因结构造成损坏，引发多种疾病，如细胞毒性、衰老、癌症等。超氧阴离子是其他几种活性氧的源头，超氧阴离子清除剂可以清除机体内的超氧阴离子，保护机体免受氧化损害。目前，超氧阴离子清除剂的种类有很多，为了得到清除效果最好的超氧阴离子清除剂，近年来，对筛选超氧阴离子清除剂的方法的研究备受:关注。
[0003]现有用于筛选超氧阴离子清除剂的方法是:已有的产生超氧阴离子的方法主要为黄嘌呤氧化酶催化法，但是黄嘌呤氧化酶催化法容易产生假阳性和假阴性结果，使检测结果不准确。而对超氧阴离子的检测与定量，主要是用紫外-可见分光光度法、电子自旋共振法、化学发光法。其中，紫外-可见分光光度法是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法，该方法操作简单、准确度高、重现性好。电子自旋共振法虽然能够直接检测产生的超氧阴离子的信号，但由于超氧阴离子寿命短，检测比较困难。而化学发光法是一种通过使用化学发光剂使体系产生化学发光，间接的检测超氧阴离子的方法，该方法由于发光时间短暂，测定困难并易产生误差，重现性较差。
【发明内容】
[0004]本发明为解决现有技术中筛选超氧阴离子清除剂的方法存在检测困难，准确度低，重现性差的技术问题，而提供了一种选用邻苯三酚碱性自氧化体系，结合紫外-可见分光光度法筛选超氧阴离子清除剂的方法。
[0005]为了解决上述技术问题， 本发明的筛选超氧阴离子清除剂的方法的技术方案具体如下:
[0006]一种筛选超氧阴离子清除剂的方法，该方法包括以下步骤:
[0007]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0008]配制pH值为8.5~9.5的30-50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液；
[0009]步骤b、标准品的配制
[0010]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐；
[0011]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0012]对照品的制备:取40微升0.4^8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升碳酸氢铵缓冲溶液或甲醇，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应10-40分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0013]样品的制备:取40微升0.4、毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧阴离子清除剂，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应10-40分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0014]空白样品的制备:取40微升0.4^8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧阴离子清除剂，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应10-40分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0015]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0016]设定紫外-可见检测波长为450纳米，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中对步骤c中制备的对照品、样品和空白样品进行测定，得到对照品、样品和空白样品的吸光度
值A对照品、A样品和A空自样品；
[0017]步骤e、超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率的计算
[0018]超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0019]I样品=[A对照品-(A样品-A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0020]式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；
[0021]Ams为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0022]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0023]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲。
[0024]在上述技术方案中，步骤a中所述的缓冲溶液优选pH值为9.0~9.5，最优选pH值为9.3。
[0025]在上述技术方案中，步骤c中所述的乙二胺四乙酸二钠盐的浓度优选为0.4-2毫
摩尔/升，最优选为2毫摩尔/升。
[0026]在上述技术方案中，所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物银杏叶水提物、刺五加叶水提物、单体木犀草素或单体芦丁。
[0027]本发明的筛选超氧阴离子清除剂的方法有益效果是:
[0028]本发明的筛选超氧阴离子清除剂的方法，是选用邻苯三酚碱性自氧化体系，结合紫外-可见分光光度法对超氧阴离子清除剂对的清除作用进行评价，避免了黄嘌呤氧化酶催化法容易产生假阳性和假阴性结果，同时克服了电子自旋共振法和化学发光法在检测超氧阴离子时，由于超氧阴离子寿命短和发光时间短暂，检测比较困难的问题。
[0029]另外，本发明的筛选超氧阴离子清除剂的方法重现性好，准确度高，操作简便。
【具体实施方式】[0030]本发明的发明思想为:本发明是选用邻苯三酚碱性自氧化体系，结合紫外-可见分光光度法对超氧阴离子清除剂的清除作用进行评价。
[0031]本发明选用邻苯三酚碱性自氧化体系产生超氧阴离子，以2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐为超氧阴离子捕集剂，加入超氧阴离子清除剂，产物水溶性甲臜在450纳米下具有光吸收，通过产物水溶性甲臜的吸光度变化计算出超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率。本方法可用于分析天然产物提取物或单体对超氧阴离子的体外清除率。
[0032]超氧阴离子清除剂清除超氧阴离子，从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4_ 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率可以通过捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化进行计算的；通过测定对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，可以对超氧阴离子清除剂的清除作用进行评价。
[0033]实施例1
[0034]本发明提供的一种筛选超氧阴离子清除剂的方法，其包括以下步骤:
[0035]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0036]配制浓度为50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为9.3 ;
[0037]步骤b、标准品的配制
[0038]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；
[0039]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0040]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升碳酸氢铵缓冲溶液，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应12分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0041]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升10毫克/毫升银杏叶水提物(碳酸氢铵缓冲溶液稀释的)，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应12分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0042]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升2毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升10毫克/毫升银杏叶水提物(碳酸氢铵缓冲溶液稀释的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应12分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0043]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0044]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A对照品；
[0045]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0046]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样
品的吸光度值A空白样品；
[0047]步骤e、超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率的计算
[0048]超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0049]I样品=[A对照品-(A样品-A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0050]式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；
[0051]A对照品为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0052]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0053]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0054]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到
2.5毫克/毫升银杏叶水提物对超氧阴离子的清除率I为53%。
[0055]超氧阴离子清除剂银杏叶水提物对超氧阴离子的清除率，是超氧阴离子清除剂银杏叶水提物清除超氧阴离子，从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以超氧阴离子清除剂银杏叶水提物对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化进行评价。
[0056]实施例2
[0057]本发明提供的一种筛选超氧阴离子清除剂的方法，其包括以下步骤:
[0058]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0059]配制浓度为30毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为9.5 ;
[0060]步骤b、标准品的配制
[0061]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；
[0062]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0063]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升碳酸氢铵缓冲溶液，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应10分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0064]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升10毫克/毫升刺五加叶水提物(碳酸氢铵缓冲溶液稀释的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应10分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0065]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升10毫克/毫升刺五加叶水提物(碳酸氢铵缓冲溶液稀释的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应10分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0066]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0067]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A5iws ；
[0068]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0069]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样
品的吸光度值A空白样品；
[0070]步骤e、超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率的计算
[0071]超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0072]I样品=[A对照品-(A样品一A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0073]式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；
[0074]A对照品为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0075]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0076]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0077]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到
2.5毫克/毫升刺五加叶水提物对超氧阴离子的清除率I为50%。
[0078]超氧阴离子清除剂刺五加叶水提物对超氧阴离子的清除率，是刺五加叶水提物清除超氧阴离子，从而导致与2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以超氧阴离子清除剂刺五加叶水提物对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化进行评价。
[0079]实施例3
[0080]本发明提供的一种筛选超氧阴离子清除剂的方法，其包括以下步骤:
[0081]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0082]配制浓度为40毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为8.5 ;
[0083]步骤b、标准品的配制
[0084]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；
[0085]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0086]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升0.4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐,加入40微升甲醇，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应40分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0087]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升0.4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升2毫摩尔/升木犀草素(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应40分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0088]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升0.4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升2毫摩尔/升木犀草素(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应40分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0089]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0090]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A5iws ；
[0091]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0092]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样
品的吸光度值A空白样品；
[0093]步骤e、超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率的计算
[0094]超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0095]I样品=[A对照品-(A样品一A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0096]式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；
[0097]A对照品为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；[0098] A#s为样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[00"] A空白样品为空白样品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0100]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到500微摩尔/升木犀草素对超氧阴离子的清除率I为93%。
[0101]超氧阴离子清除剂木犀草素对超氧阴离子的清除率，是超氧阴离子清除剂木犀草素清除超氧阴离子，从而导致与2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以超氧阴离子清除剂木犀草素对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化进行评价。
[0102]实施例4
[0103]本发明提供的一种筛选超氧阴离子清除剂的方法，其包括以下步骤:
[0104]步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制
[0105]配制浓度为45毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液，调节pH值为9.0 ；
[0106]步骤b、标准品的配制
[0107]用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)_2H_四氮唑钠盐，能和超氧阴离子反应产生水溶性甲臜染料；
[0108]步骤C、对照品、样品和空白样品的制备
[0109]对照品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐,加入40微升甲醇，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应34分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0110]样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升2毫摩尔/升芦丁(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐,最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应34分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定;
[0111]空白样品的制备:反应总体积160微升，先加入40微升4毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升2毫摩尔/升芦丁(甲醇溶解的)，加入40微升50微摩尔/升的的
2-(4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应34分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；
[0112]步骤d、对照品、样品和空白样品的检测
[0113]对照品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c制备的对照品进行测定，得到对照品的
吸光度值A5iws ；[0114]样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的样品进行测定，得到样品的吸光度值
A样品；
[0115]空白样品检测:以96孔板为载体，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中进行测定，设定紫外-可见检测波长为450纳米，对步骤c配制的空白样品进行测定，得到空白样
品的吸光度值A空白样品；
[0116]步骤e、超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率的计算
[0117]超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算:
[0118]I样品=[A对照品-(A样品一A空白样品)]/ A对照品X 100%
[0119]式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率；
[0120]Ams为对照品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0121]A#s为样品中2-(4-碘苯)-3_ (4-硝基苯)-5_ (2’4-二磺基苯)-2H_四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0122]A空白样品为空白样品中2_ (4-碘苯)_3_ (4_硝基苯)-5- (2’ 4_ 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；
[0123]根据测得的对照品、样品和空白样品中2-(4-碘苯)-3_(4-硝基苯)-5_(2’ 4_ 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，经计算得到500微摩尔/升芦丁对超氧阴离子的清除率I为61%。
[0124]超氧阴离子清除剂芦丁对超氧阴离子的清除率，是超氧阴离子清除剂芦丁清除超氧阴离子，从而导致与2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐反应的超氧阴离子的量减少，致使捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的还原产物水溶性甲臜染料的量减少；所以超氧阴离子清除剂芦丁对超氧阴离子的清除率是通过捕集剂2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜染料含量的变化进行评价。
[0125]显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【权利要求】
1.一种筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制 配制PH值为8.5~9.5的30-50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液； 步骤b、标准品的配制 用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2- (4-碘苯)-3- ( 4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐； 步骤C、对照品、样品和空白样品的制备 对照品的制备:取40微升0.1~8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升碳酸氢铵缓冲溶液或甲醇，加入40微升50微摩尔/升的2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应10-40分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定； 样品的制备:取40微升0.1~8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧阴离子清除剂，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升I毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37°C反应10-40分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定； 空白样品的制备:取40微升0.4^8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧阴离子清除剂，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37°C反应10-40分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定； 步骤d、对照品、样品和空白样品的检测 设定紫外-可见检测波长为450纳米，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中对步骤c中制备的对照品、样品和空白样品进行测定，得到对照品、样品和空白样品的吸光度值Aw照品、A样品矛卩A空白样品； 步骤e、超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率的计算 超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算: I样品=[A对照品"(A样品"A空白样品)]/ A对照品X 100% 式中，I为超氧阴离子清除剂对超氧阴离子的清除率； AwmsS对照品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲； A#s为样品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2’4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲； A空白样品为空白样品中2- (4-碘苯)-3- (4-硝基苯)-5- (2’ 4- 二横基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲。
2.如权利要求1所述的筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，步骤a中所述的缓冲溶液pH值为9.0~9.5。
3.如权利要求2所述的筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，步骤a中所述的缓冲溶液PH值为9.3。
4.如权利要求1所述的筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，步骤c中所述的乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为0.4~2毫摩尔/升。
5.如权利要求4所述的筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，步骤c中所述的乙二胺四乙酸二钠盐的浓度为2毫摩尔/升。
6.如权利要求1所述的筛选超氧阴离子清除剂的方法，其特征在于，所述的超氧阴离子清除剂是天然产物提取物银杏叶水提物、刺五加叶水提物、单体木犀草素或单体芦丁。
【文档编号】G01N21/31GK103674862SQ201210341636
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2012年9月14日
【发明者】刘志强, 徐晨, 刘舒, 邢俊鹏, 宋凤瑞, 郑重, 刘淑莹 申请人:中国科学院长春应用化学研究所