荧光探针及其制备方法与在检测超氧阴离子中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种荧光探针及其制备方法与在检测超氧阴离子中的应用，荧光探针的结构式如下：该荧光探针的制备方法为在惰性气体保护下，将三聚氰胺、咖啡酸溶于DMF和CH2Cl2的混合液中，再加入HOBT和EDC.HCL，室温下搅拌反应8～16小时；反应后，浓缩，除去溶剂，得荧光探针粗产品；再将荧光探针粗产品用硅胶薄层色谱板分离提纯，即得荧光探针纯品。本发明的荧光探针结构新颖、灵敏度、选择性好、光稳定性好。
【专利说明】荧光探针及其制备方法与在检测超氧阴离子中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种荧光探针，及其制备方法，以及在检测超氧阴离子中的应用，属于 生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 大量证据表明，活性氧（ROS)与许多疾病的发生发展密切相关，例如退行性疾病， 手术中的缺血在灌注损伤等。由于超氧阴离子自由基（〇 2'_)是其他R〇S(包括过氧化氢，过 氧化亚硝酰阴离子等）的前体，因此揭示O2'_的水平与疾病的关系显得尤为重要。
[0003] 灵敏性高是单光子（OP)荧光成像的明显优势，所以应用OP荧光显微镜可视化细 胞内的O 2 ^水平是一种有效检测O2'1 勺方法。但是，目前检测细胞内O2 ^的荧光探针仍然 存在诸多问题，例如：来自其他ROS对小分子荧光探针测定的干扰；响应时间较长；不可逆 反应等。
[0004] 双光子（TP)荧光成像的优势包括更深的穿透深度和更低的样本光损伤，这是由 于TP荧光是同时吸收两个能量更低的光子激发造成的。但是目前检测细胞和活体内O 2勺 TP荧光探针尚未见报道。鉴于细胞内O2 ^的浓度极低、寿命短、对环境敏感等特点，检测 〇2'_的探针既需要具备深组织成像和光损伤低的特性，还需要高灵敏度、瞬时和可逆性；此 夕卜，还应便于根据不同样品的厚度灵活地选择成像方式。因此检测O 2^的探针的设计仍是 生命科学与化学分析领域最困难的问题之一。
【发明内容】
[0005] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种动态、可逆检测超氧阴离子的荧光 探针，及其制备方法，以及其基于单双光子双模式荧光成像在检测细胞和活体内超氧阴离 子的应用，该荧光探针结构新颖、灵敏度、选择性好、光稳定性好。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的荧光探针，其结构式如下式I所示：
[0008]
【权利要求】
1. 一种荧光探针，其特征在于，该荧光探针的结构式如式I所示：
2. 权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，步骤如下： 在惰性气体保护下，将三聚氰胺、咖啡酸溶于DMF和CH2Cl2的混合液中，再加入HOBT和 EDC. HCL，室温下搅拌反应8?16小时；反应后，浓缩，除去溶剂，得荧光探针粗产品； 再将荧光探针粗产品用硅胶薄层色谱板分离提纯，即得荧光探针纯品； 所述三聚氰胺、咖啡酸、HOBT和EDC. HCL四者的物质的量比为1: (2-3. 5) : (2-3. 5): (2-3. 5)； 所述DMF和CH2Cl2的混合液中，DMF和CH2Cl2的体积比为1 :2-6。
3. 如权利要求2所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述三聚氰胺、咖啡酸、 HOBT和EDC四者的物质的量比为1:2 :2 :2。
4. 如权利要求2所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述DMF和CH2Cl2的混合 液中，DMF和CH 2Cl2的体积比为1 :4。
5. 如权利要求2所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述用硅胶薄层色谱板分 离提纯时，洗脱剂为乙酸乙酯-环己烷混合液，其中，乙酸乙酯：环己烷的体积比为5 :1。
6. 权利要求1所述的荧光探针在检测细胞内O2^中的应用。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，应用方法为：将培养好的待检测细胞放于含 有探针分子的缓冲溶液中孵化，孵化后，将细胞用生理PBS缓冲液洗去多余的探针，然后进 行激光共聚焦显微成像。
【文档编号】C07D251/70GK104371707SQ201410606425
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月31日 优先权日:2014年10月31日
【发明者】唐波, 李平, 张雯, 肖海滨 申请人:山东师范大学