一种米尔贝肟的分离纯化方法
【专利摘要】本发明提供了一种米尔贝肟的分离纯化方法，包括以下步骤：将待分离样品采用硅胶柱层析进行粗分离，所述硅胶柱层析采用湿法装柱、干法上样；将粗分离后的产物采用高效液相色谱纯化；将纯化后的样品采用纳滤膜进行浓缩，制得浓缩液；将浓缩液减压蒸发，然后过滤干燥后制得精纯品；将精纯品溶解后升温，再滴加异辛醇、正庚烷或石油醚，然后降温使其结晶，过滤后制得结晶品；将结晶品溶解后过滤，将滤液滴加至持续搅拌的纯净水中，滴加完成后抽滤制得转晶品；将转晶品进行干燥，干燥后进行粉碎，粉碎后重新干燥即制得米尔贝肟成品。该方法在国内首次实现了米尔贝肟的工业化生产，并且所制得产品纯度和收率均高于国内外同类产品。
【专利说明】—种米尔贝肟的分离纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化学品的分离纯化领域，具体涉及一种半合成大环内酯类驱虫药米尔贝肟的分离纯化方法。
【背景技术】
[0002]米尔贝月亏(Milbemycin Oxime)是大环内酯类抗体内外寄生虫药物,是米尔贝霉素A3和A4的肟衍生物，其中米尔贝A4肟不得低于80%。A3肟不得超过20%。米尔贝肟具有广谱的抗寄生虫作用，对体内、体外寄生虫特别是线虫和节肢动物有良好的驱杀作用。Lee等通过米尔贝肟对广东血圆线虫和犬恶丝虫体外活力的神经药理学机制研究显示，米尔贝月亏对两种虫体的抑制和刺激效应是通过的gabergic和胆碱能机制实现的。药物与祀虫细胞上的特异性高亲合力的位点结合，影响了细胞膜对Cl-的通透性，继而引起线虫的神经细胞及节肢动物的肌细胞抑制性神经递质Y-氨基丁酸(GABA)的释放量增加，打开谷氨酸控制的Cl-通道，增强神经膜对Cl-的通透性，GABA作用于突触前神经末梢，减少兴奋性递质的释放，使突触后膜产生兴奋性突触后电位减弱，突触后神经元因膜电位的去极化程度达不到阈值而不能进入兴奋状态，从而引起抑制，虫体麻痹、死亡。哺乳的主要外周神经传递介质是乙酰胆碱，不受影响，虽然此类药对大脑中枢神经系统内的GABA有一定影响，但其不易通过血一脑屏障，因此在推荐使用剂量下使用对脊椎动物无毒副作用。本类药物进入到体内后极少分布到哺乳动物脑组织，因此可以选择性地作用于宿主的体内外寄生虫，而对动物宿主本身不表现作用。
[0003]关于米尔贝肟的文献报道主要集中在米尔贝霉素的发酵和菌种选育方面，尚无米尔贝肟分离纯化的文献报道。CN 101037442A公开了一种利用冰城链霉菌制备α -型米尔贝霉素的方法。该方法采用甲醇提取，乙酸乙酯萃取，硅胶层析及C18制备色谱纯化得到α -型米尔贝霉素。徐倩倩等在《中国兽药杂志》上发表的米尔贝肟的研究进展，该文综述了米尔贝肟的理化性质、作用机理以及对各种体外寄生虫的驱杀作用。目前该药已在日本、美国、欧盟等国家上市，国内尚未有关于米尔贝肟的分离纯化的文献报道。
【发明内容】
[0004]本发明解决了【背景技术】中的不足，提供了一种米尔贝肟的分离纯化方法，该方法在国内首次实现了米尔贝肟的工业化生产，并且所制得产品纯度和收率均高于国内外同类
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[0005]实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
[0006]一种米尔贝肟的分离纯化方法，包括以下步骤:(I)、将待分离样品采用硅胶柱层析进行粗分离，所述硅胶柱层析采用湿法装柱、干法上样，上样量为柱体积的5%?20% ；
[0007](2)、将粗分离后的产物采用高效液相色谱纯化；
[0008](3)、将纯化后的样品采用纳滤膜进行浓缩，制得浓缩液，所述纳滤膜的截留分子量为 200 ?100Da ；
[0009](4)、将浓缩液减压蒸发，然后过滤干燥后制得精纯品；
[0010](5)、将精纯品采用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯溶解后升温，再滴加异辛醇、正庚烷或石油醚，然后降温使其结晶，过滤后制得结晶品；
[0011]￠)、将结晶品用甲醇、乙醇或丙酮溶解后过滤，将滤液滴加至持续搅拌的纯净水中，滴加完成后抽滤制得转晶品；
[0012](7)、将转晶品进行干燥，干燥后进行粉碎，粉碎后重新干燥即制得米尔贝肟成品。
[0013]所述步骤(I)中所述的湿法装柱具体为:将硅胶用0.8?2.5倍体积的氯仿浸泡并搅拌均匀后倒入柱内，柱床的高径比控制在(8?15):1，然后用正己烷、正庚烷、异辛烷或石油醚洗脱平衡，洗脱体积为I?4个柱体积。
[0014]所述步骤(I)中所述的干法上样具体为:将待分离样品用丙酮溶解，再与硅胶拌勻,在35?45°C下真空干燥4?1h,所述丙酮、娃胶与样品质量比为(0.25?2): (0.7?
1.5):1。
[0015]所述的硅胶柱层析中的流动相为溶剂A与溶剂B按照(90?99):1的体积比混合后的混合溶剂，其中溶剂A为正己烷、正庚烷、异辛烷及石油醚中的一种，溶剂B为甲醇、丙酮及乙酸乙酯中的一种。
[0016]所述步骤⑵中所述高效液相色谱所用填料为CS硅胶，填料粒径为3?10 μ m，比表面积为200?600m2/g。流动相为甲醇、乙腈和水的混合物，其比例为:(70?90): (5?10): (5 ?20)。
[0017]所述步骤(2)中所述高效液相色谱采用甲醇-三氯甲烷溶解上样，甲醇与三氯甲烷体积比为(0.8?1.8): 1，样品浓度为0.80?1.5g/mL，进样量为每千克填料每次进5?15g样品。
[0018]所述步骤(3)中所述纳滤膜为聚偏氟乙烯、聚酰胺、聚醚砜和壳聚糖中的一种。
[0019]所述步骤(5)的具体方法为:先用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯将精纯品溶解，所用溶剂体积与精纯品质量之比为(0.8?3):lmL/g ;然后将溶液置于40?70°C搅拌，搅拌速度为30?90rpm ;达到设定温度后开始滴加异辛醇、正庚烷、石油醚中的一种，滴加时间为10?30min ;待出现浑浊后将温度调节为10?30°C，继续搅拌3?8h后过滤。
[0020]所述步骤(6)的具体方法为:先用甲醇、乙醇或丙酮将结晶品溶解，所用溶剂体积与结晶品质量之比为(4?7):lmL/g ;溶解后的溶液用0.45 μ m滤膜过滤，将滤液滴加到剧烈搅拌且经过滤的纯化水中，搅拌速度为30?90rpm，滤液的滴加时间为I?3h，滴加完成后继续搅拌30min?2h ;最后采用G4砂芯漏斗抽滤制得转晶品。
[0021]所述步骤(7)的具体方法为:将转晶品放入真空干燥箱中进行干燥，干燥温度为30?40°C，干燥时间为10?20h，干燥后进行粉碎，过100目?300目筛，粉碎后重新置于真空干燥箱中进行干燥，干燥温度55?75°C，干燥时间4?7h，最后即制得米尔贝肟成品。
[0022]本发明提供的米尔贝肟的分离纯化方法与现有技术相比存在以下优点:1、本发明能够实现工业化生产。2、本发明所制得的产品纯度可高达99 %，收率可高达96 %，两者均高于现有的同类产品。3、在本发明中创造性的使用了纳米过滤技术，实现了溶剂的循环使用，既降低了成本，又减少了环境污染，而且大大提高了产能。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明实施例1中所使用的米尔贝肟粗品液相色谱检测所得的谱图；
[0024]图2为本发明实施例1中所制得的米尔贝肟成品液相色谱检测所得的谱图；
[0025]图3为米尔贝肟的USP对照品液相色谱检测所得的谱图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图及具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
[0027]实施例1
[0028](I)、称取120g米尔贝肟粗品，粗品的液相色谱检测谱图如图1所示，其中米尔贝月亏A4标定含量为8.4 %,米尔贝月亏A3的标定含量为5.6 %,将米尔贝月亏粗品用IlOg丙酮溶解，再加入120g硅胶拌匀，置于真空干燥箱中在35?45°C下真空干燥4?1h ;再称取240g柱层析硅胶，将硅胶用0.8?2.5倍体积的氯仿浸泡并搅拌均匀后倒入Φ6.8CmX100Cm玻璃层析柱内，拍打均勻，用1500mL正庚烷洗脱平衡；然后将干燥后的混合物用300mL正庚烷调匀，加载到柱上，上样量为柱体积的5%?20% ;
[0029]采用正庚烷/丙酮的混合溶剂作为流动相进行洗脱，正庚烷/丙酮的体积比为97:3, HPLC监测米尔贝肟的洗脱情况，收集米尔贝肟A3和A4总纯度大于40%的组分，35°C减压蒸干，得米尔贝肟粗纯品47.5g。
[0030](2)、高效液相色谱所用填料为C8硅胶，填料粒径为3?10 μ m，比表面积为200?600m2/g。
[0031]将米尔贝肟粗纯品用25mL三氯甲烷和25mL甲醇混合溶剂溶解，用进样针吸取40mL注入进样阀上样，进样量为每千克填料每次进5?15g样品。
[0032]采用甲醇/乙腈/水的混合溶液作为流动相洗脱，三者的体积比为75:10:15，分别收集米尔贝肟A3和米尔贝肟A4的洗脱峰，收集得到两者的洗脱液。
[0033](3)、将洗脱液采用聚偏氟乙烯纳滤膜进行浓缩10倍，制得浓缩液，透过液作为流动相重复使用，所述纳滤膜的截留分子量为350?500Da ；
[0034](4)、将浓缩液均在45°C下减压蒸发至不滴，G4砂芯过滤，45°C真空干燥5h，将米尔贝]3亏A3和米尔贝月亏A4调配成A3/A4为1:4.1，得米尔贝月亏精纯品17.8g ；
[0035](5)、将精纯品先用72mL三氯甲烷溶解，然后将溶液置于500mL三角瓶中，升温至60°C并磁力搅拌，搅拌速度为30?90rpm ;达到设定温度后开始滴加正庚烷，滴加时间为10?30min ;待出现白色浑浊后将温度调节为30°C，继续搅拌6h后，G4砂芯过滤。将结晶品按上述方法重结晶2次，最后在40°C下干燥5h，称重得米尔贝肟结晶品12.9g
[0036](6)、将结晶品用先用65mL丙酮溶解，45°C旋干，然后再加入65mL丙酮溶解，溶解后的溶液用0.45 μ m滤膜过滤，将滤液滴加到90mL剧烈搅拌且经过滤的纯化水中，搅拌速度为30?90rpm,滤液的滴加时间为I?3h,滴加完成后继续搅拌30min?2h ;最后采用G4砂芯漏斗抽滤制得转晶品。
[0037](7)、将转晶品放入真空干燥箱中进行干燥，干燥温度为40°C，干燥时间为12h，干燥后进行粉碎，过100目?300目筛，粉碎后重新置于真空干燥箱中进行干燥，干燥温度65°C，干燥时间6h，最后即制得米尔贝肟成品12.Hg，其液相色谱检测谱图如图2所示，图3为米尔贝肟的USP对照品液相色谱检测所得的谱图，成品中米尔贝肟A3含量为19.32%,米尔贝肟A4含量为79.41 %，米尔贝肟A4总收率为95.34%。
[0038]实施例2
[0039](I)、称取3Kg米尔贝肟粗品，其中米尔贝肟A4标定含量为8.7%，米尔贝肟A3的标定含量为6.5%，将米尔贝肟粗品用3.1lKg丙酮溶解，再加入3Kg硅胶拌匀，置于真空干燥箱中在40°C下真空干燥6h ;再称取6Kg柱层析硅胶，将硅胶用12L氯仿浸泡并搅拌均匀后倒入Φ22.8cmX 10cm玻璃层析柱内，拍打均匀，用40L正庚烷洗脱平衡；然后将干燥后的混合物用7.5L正庚烷调匀，加载到柱上，上样量为柱体积的5%?20% ;
[0040]采用正庚烷/丙酮的混合溶剂作为流动相进行洗脱，正庚烷/丙酮的体积比为97:3, HPLC监测米尔贝肟的洗脱情况，收集米尔贝肟A3和A4总纯度大于40%的组分，35°C减压蒸干，得米尔贝肟粗纯品1375.Sg。
[0041 ] (2)、高效液相色谱所用填料为C8硅胶，填料粒径为3?10 μ m，比表面积为200?600m2/g。
[0042]将米尔贝肟粗纯品用700mL三氯甲烷和700mL甲醇混合溶剂溶解，用进样针吸取40mL注入进样阀上样，进样量为每千克填料每次进5?15g样品。
[0043]采用甲醇/乙腈/水的混合溶液作为流动相洗脱，三者的体积比为75:10:15，分别收集米尔贝肟A3和米尔贝肟A4的洗脱峰，收集得到两者的洗脱液。
[0044](3)、将洗脱液采用聚偏氟乙烯纳滤膜进行浓缩10倍，制得浓缩液，透过液作为流动相重复使用，所述纳滤膜的截留分子量为350?500Da ；
[0045](4)、将浓缩液均在50°C下减压蒸发至不滴，G4砂芯过滤，45°C真空干燥5h，将米尔贝月亏A3和米尔贝月亏A4调配成A3/A4为1-A.1，得米尔贝月亏精纯品487.6g ；
[0046](5)、将精纯品先用2L三氯甲烷溶解，然后将溶液置于20L结晶釜中，升温至60°C并磁力搅拌，搅拌速度为30?90rpm ;达到设定温度后开始滴加4.5L正庚烷，滴加时间为10?30min ;待出现白色浑浊后将温度调节为30°C，继续搅拌6h后，G4砂芯过滤。将结晶品按上述方法重结晶2次，最后在40°C下干燥5h，称重得米尔贝肟结晶品343.5g
[0047](6)、将结晶品用先用1.75L丙酮溶解，45°C旋干，然后再加入1.75L丙酮溶解，溶解后的溶液用0.45 μ m滤膜过滤，将滤液滴加到3.15L剧烈搅拌且经过滤的纯化水中，搅拌速度为30?90rpm,滤液的滴加时间为Ih,滴加完成后继续搅拌30min?2h ;最后采用G4砂芯漏斗抽滤制得转晶品。
[0048](7)、将转晶品放入真空干燥箱中进行干燥，干燥温度为40°C，干燥时间为12h，干燥后进行粉碎，过100目?300目筛，粉碎后重新置于真空干燥箱中进行干燥，干燥温度65°C，干燥时间6h，最后即制得米尔贝肟成品316.7g，成品中米尔贝肟A3含量为19.07%,米尔贝肟A4含量为79.33 %，米尔贝肟A4总收率为95.03 %。
【权利要求】
1.一种米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤:(1)、将待分离样品采用硅胶柱层析进行粗分离，所述硅胶柱层析采用湿法装柱、干法上样，上样量为柱体积的5%?20% ； (2)、将粗分离后的产物采用高效液相色谱纯化； (3)、将纯化后的样品采用纳滤膜进行浓缩，制得浓缩液，所述纳滤膜的截留分子量为200 ?100Da ； (4)、将浓缩液减压蒸发，然后过滤干燥后制得精纯品； (5)、将精纯品采用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯溶解后升温，再滴加异辛醇、正庚烷或石油醚，然后降温使其结晶，过滤后制得结晶品； (6)、将结晶品用甲醇、乙醇或丙酮溶解后过滤，将滤液滴加至持续搅拌的纯净水中，滴加完成后抽滤制得转晶品； (7)、将转晶品进行干燥，干燥后进行粉碎，粉碎后重新干燥即制得米尔贝肟成品。
2.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(I)中所述的湿法装柱具体为:将硅胶用0.8?2.5倍体积的氯仿浸泡并搅拌均匀后倒入柱内，柱床的高径比控制在(8?15):1，然后用正己烷、正庚烷、异辛烷或石油醚洗脱平衡，洗脱体积为I?4个柱体积。
3.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(I)中所述的干法上样具体为:将待分离样品用丙酮溶解，再与硅胶拌匀，在35?45°C下真空干燥4?10h，所述丙酮、硅胶与样品质量比为(0.25?2): (0.7?1.5):1。
4.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:所述的硅胶柱层析中的流动相为溶剂A与溶剂B按照(90?99):1的体积比混合后的混合溶剂，其中溶剂A为正己烷、正庚烷、异辛烷及石油醚中的一种，溶剂B为甲醇、丙酮及乙酸乙酯中的一种。
5.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(2)中所述高效液相色谱所用填料为C8硅胶，填料粒径为3?10 μ m，比表面积为200?600m2/g ;流动相为甲醇、乙腈和水的混合物，其比例为:(70?90): (5?10): (5?20)。
6.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(2)中所述高效液相色谱采用甲醇-三氯甲烷溶解上样，甲醇与三氯甲烷体积比为(0.8?1.8):1，样品浓度为0.80?1.5g/ml，进样量为每千克填料每次进5?15g样品。
7.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(3)中所述纳滤膜为聚偏氟乙烯、聚酰胺、聚醚砜和壳聚糖中的一种。
8.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(5)的具体方法为:先用二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮或乙酸乙酯将精纯品溶解，所用溶剂体积与精纯品质量之比为(0.8?3):lml/g ;然后将溶液置于40?70°C搅拌，搅拌速度为30?90rpm ;达到设定温度后开始滴加异辛醇、正庚烷、石油醚中的一种，滴加时间为10?30min ;待出现浑浊后将温度调节为10?30°C，继续搅拌3?8h后过滤。
9.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(6)的具体方法为:先用甲醇、乙醇或丙酮将结晶品溶解，所用溶剂体积与结晶品质量之比为(4?7):lml/g ;溶解后的溶液用0.45 μ m滤膜过滤，将滤液滴加到剧烈搅拌且经过滤的纯化水中，搅拌速度为30?90rpm,滤液的滴加时间为I?3h,滴加完成后继续搅拌30min?2h ;最后米用G4砂芯漏斗抽滤制得转晶品。
10.根据权利要求1所述的米尔贝肟的分离纯化方法，其特征在于:步骤(7)的具体方法为:将转晶品放入真空干燥箱中进行干燥，干燥温度为30?40°C，干燥时间为10?20h，干燥后进行粉碎，过100目?300目筛，粉碎后重新置于真空干燥箱中进行干燥，干燥温度55?75°C，干燥时间4?7h，最后即制得米尔贝肟成品。
【文档编号】C07D493/22GK104327094SQ201410606012
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】何福彪, 付光明, 张文凯 申请人:湖北宏中药业有限公司