专利名称：过氧化物阴离子用电极及使用该电极的传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物体内的过氧化物阴离子自由基(O2--)等过氧化物阴离子用电极以及使用该浓度测定用电极的过氧化物阴离子浓度测定用传感器。更详细地说，涉及能够适用于生物体内(in vivo)且不受诸如过氧化氢等存在于测定体系内的致毒性物质的影响的过氧化物阴离子用电极以及过氧化物阴离子的浓度测定用传感器。
背景技术：
作为活性氧种的过氧化物阴离子自由基(O2--)，在生物体内其是通过黄嘌呤和次黄嘌呤等在黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(XOD)作用下氧化成尿酸以及氧被血红蛋白还原等而生成的，其与生物体内的生理活性物质的合成、杀菌作用、老化现象等相关，具有重要的作用。另一方面，认为由过氧化物阴离子自由基派生的各种活性氧种引起癌症等各种疾病，因此生物体内的含有过氧化物阴离子自由基的活性氧种的浓度测定对于判定上述各种疾病也是重要的。
如式(1)所示，在不存在基质时，该过氧化物阴离子自由基通过歧化反应形成过氧化氢(H2O2)和氧气分子(O2)。该歧化反应包括质子向过氧化物阴离子自由基加成而生成HO2·；HO2·与氧气分子反应而生成过氧化氢和氧气分子；以及HO2·之间碰撞而生成过氧化氢和氧气分子(式(1)～式(4))。
2H++2O2-·→H2O2+O2……(1)H++O2-·→HO2· ……(2)HO2·+O2-·+H+→H2O2+O2……(3)HO2·+HO2·→H2O2+O2……(4)该反应体系中，过氧化物阴离子自由基以电子受体(氧化剂)、电子供体(还原剂)以及氢离子的受体(碱)的形式发挥作用，利用其中前两者的性质，尝试进行过氧化物阴离子自由基的浓度测定。例如，利用铁细胞色素c(3价)向亚铁细胞色素c(2价)的转换反应、由硝基四唑氮蓝(NBT)生成甲瓒蓝的反应以及四硝基甲烷(TNM)的还原反应，尝试进行过氧化物阴离子自由基的浓度测定，但是这些都是体外(in vitro)测定方法。
另一方面，也对定量地检测生物体内(in vivo)的过氧化物阴离子自由基的浓度的方法进行了研究。例如，McNeil等人、Tariov等人、Cooper等人指出，用作为酶的N-乙酰半胱氨酸修饰金或铂电极的表面，使蛋白质在其上形成S-Au键而得以固定，制得酶电极(细胞色素c固定化电极)，所述蛋白质是细胞色素c等被称作亚铁血红素的蛋白质，其是以铁配位化合物为氧化还原中心的金属蛋白质，由此可以通过电化学方法检测过氧化物阴离子自由基的浓度(C.J.McNeil et al.Free Radical Res.Commun.，7，89(1989)；M.J.Tariov et al.J.Am.Chem.Soc.113，1847(1991)；J.M.Cooper，K.R.Greenough and C.J.McNeil，J.Electroanal.Chem.，347，267(1993))。
该检测方法的测定原理如下即，细胞色素c(3价)(cyt.c(Fe3+))与过氧化物阴离子自由基发生如式(5)所示的反应，还原为细胞色素c(2价)(cyt.c(Fe2+))。然后，如式(6)所示，通过O2-电化学地将还原得到的细胞色素c(2价)再次氧化，测定此时的氧化电流，由此间接地定量检测过氧化物阴离子自由基的浓度。
cyt.c(Fe3+)+O2-→cyt.c(Fe2+)+O2……(5)cyt.c(Fe2+)→cyt.c(Fe3+)+e-……(6)但是，由于细胞色素c是存在于生物体细胞内的线粒体的膜上的电子转移蛋白质，所以为了制作固定了足够上述测定的量的细胞色素c的电极，必需多达105个～106个的大量的细胞，此外，也存在所使用的酶在数日内失活的问题。
此外，本发明人首先发现，如果电极在导电性部件的表面上形成有金属卟啉配位化合物的聚合膜，则这样的电极不需要大量的酶，此外，也无失活的问题，可以用于检测活性氧种的存在或浓度，并提出了专利申请(WO 03/054536)，其中所述金属卟啉配位化合物在卟啉化合物的中心导入了金属原子。
但是，由于上述反应所示的过氧化物阴离子自由基的歧化反应中产生过氧化氢，而且其是金属卟啉配位化合物聚合膜的致毒物质，必须想办法使得测定过氧化物阴离子时不受其影响。
因此，本发明期待开发出一种电极，其能简单地测定过氧化物阴离子自由基，并且消除了所产生的过氧化氢等致毒性物质的影响。
发明内容
本发明人对在导电性部件的表面上形成有金属卟啉配位化合物的聚合膜的电极进一步进行改进性能的精心研究时发现，通过使用特定种类间位取代基的卟啉化合物以及特定的轴向配体，可以防止由于中毒所导致的影响，从而完成了本发明。
即，本发明提供过氧化物阴离子用电极，该过氧化物阴离子用电极的特征在于，在导电性部件的表面上形成有金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的电解聚合膜。
此外，本发明提供过氧化物阴离子浓度测定用传感器，该过氧化物阴离子浓度测定用传感器含有活性氧种用电极、反电极和参比电极；所述活性氧种用电极是在导电性部件的表面上形成金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜来形成的。
进一步地，本发明提供样品中的过氧化物阴离子的检测方法，该方法中，用上述传感器测定金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物聚合膜中的金属和过氧化物阴离子之间的氧化还原反应所产生的电流。
图1是说明为了制造本发明电极而使用的3电极式电池的一个例子的图。
图2是说明为了制造本发明电极而使用的2室型3电极式电池的一个例子的图。
图3是说明为了制造本发明电极而使用的针型电极和2室型3电极式电池的一个例子的图。图中，(A)说明2室型3电极式电池，(B)说明针型电极整体，(C)说明针型电极的末端部分。
图4是说明为了制造本发明电极而使用的改进的针型电极的图，图中，(A)说明改进的针型电极整体，(B)说明改进的针型电极的末端部分。
图5是说明用于活性氧种的测定用的测定装置一个例子的图。
图6是说明用于活性氧种的测定用的测定装置的另一个例子的图。
图7是说明[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)]溴化物的紫外-可见光光谱的图。
图8是说明[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)二(咪唑基)]溴化物的紫外-可见光光谱的图。
图9是说明5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉的紫外-可见光光谱的图。
图10是说明本发明品的电解聚合时的CV曲线的图。
图11是说明比较品1的添加XOD时的氧化电流的随着时间推移而变化的图。
图12是说明本发明品1的添加XOD时的氧化电流的随着时间推移而变化的图。
具体实施例方式
本发明的过氧化物阴离子用电极(下文称为“电极”)在导电性部件的表面上形成有金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜。
作为构成本发明的电极的导电性部件，只要是一般作为电极用而使用的部件，则使用可不受不特别限制，例如，可以使用玻璃化炭黑(GlassyCarbonGC)、石墨、热解石墨(PG)、高定向热解石墨(HOPG)、活性炭等碳类；铂、金、银等贵金属；或In2O3/SnO2(ITO)等，但是特别是考虑到经济性、加工性、轻量性等时，优选使用玻璃化炭黑。此外，对于导电性部件的形状，只要是能够用作电极的形状，则没有特别限制，可以为圆柱状、棱柱状、针状、纤维(fiber)状等各种形状，但是，例如，为了测定生物体内的过氧化物阴离子浓度，优选为针状的形状。
本发明中，在上述导电性部件的表面上形成有金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜，作为用于形成该金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜的金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的例子，可以举出下述式(I)所示的化合物。
(式中，M表示II价和III价之间的氧化还原电位比O2-·的氧化电位高而比水的氧化电位低的金属，4个R中的至少1个表示硫代呋喃基，2个L中的至少1个表示提供络合形成常数大于等于104M-2且稳定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的轴向配体)上述式(I)所示的金属硫代呋喃基卟啉配位化合物中，作为M即II价和III价之间的氧化还原电位比O2--的氧化电位高而比水的氧化电位低的金属，可以举出铁(III)或锰(III)等。此外，作为R的硫代呋喃基，可以举出2-硫代呋喃基、3-硫代呋喃基等。进一步地，L作为提供大于等于络合形成常数且稳定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的轴向配体，可以举出咪唑衍生物，例如甲基咪唑、乙基咪唑、丙基咪唑、二甲基咪唑等烷基咪唑；苄基咪唑等芳基烷基咪唑等；或苯并咪唑等。
本发明的金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物是轴向配体和金属原子配位于硫代呋喃基卟啉化合物的配位化合物。该硫代呋喃基卟啉化合物是4个吡咯环在α位置与4个甲基交互键合的环状化合物，且其是4个氮原子朝向中心而形成的，其具有至少一个硫代呋喃基作为次甲基的取代基(式(I)中，R)。其它的次甲基的取代基可以是相同的硫代呋喃基或其它的基团，例如，吡咯基、呋喃基、巯基苯基、氨基苯基、羟基苯基、烷基、芳基(aryl)等或氢原子。
作为本发明中所使用的硫代呋喃基卟啉化合物的例子，可以举出5，10，15，20-四(2-硫代呋喃基)卟啉、5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉、[5，10，15-三(2-硫代呋喃基)-20-单(苯基)]卟啉、[5，10，15-三(3-硫代呋喃基)-20-单(苯基)]卟啉、[5，10-二(2-硫代呋喃基)-15，20-二(苯基)]卟啉、[5，10-二(3-硫代呋喃基)-15，20-二(苯基)]卟啉、[5，15-二(2-硫代呋喃基)-10，20-二(苯基)]卟啉、[5，15-二(3-硫代呋喃基)-10，20-二(苯基)]卟啉、[5-单(2-硫代呋喃基)-10，15，20-三(苯基)]卟啉、[5-单(3-硫代呋喃基)-10，15，20-三(苯基)]卟啉等。
此外，对于该硫代呋喃基卟啉化合物的轴向配体(式(I)中，L)的至少1个必须为上述咪唑衍生物，作为其它的轴向配体，可以为咪唑衍生物或其它的轴向配体，所述其它的轴向配体例如有吡啶及其衍生物、苯胺及其衍生物、组氨酸及其衍生物、三甲胺及其衍生物等氮类轴向配体；苯硫酚及其衍生物、半胱氨酸及其衍生物、蛋氨酸及其衍生物等硫类轴向配体；苯甲酸及其衍生物、乙酸及其衍生物、苯酚及其衍生物、脂肪族醇及其衍生物、水等氧类轴向配体。
通过在具有上述轴向配体的硫代呋喃基卟啉化合物中导入金属原子(式(I)中，M)，可以以配位化合物的形式形成金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物。形成该配位化合物时，可以使用通常所使用的金属配位化合物的形成方法，例如，可以使用金属化(Metalation)等方法，将金属原子导入硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的中心。
本发明中，在导电性部件的表面上形成上述金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜时，可以使用电解聚合法、溶液聚合法、非均相聚合法等各种聚合方法。其中，优选使用电解聚合法来形成聚合膜，具体地说，在二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等有机溶剂中，加入高氯酸四丁基铵(TBAPBu4NClO4)、高氯酸四丙基铵(TPAPPr4NClO4)、高氯酸四乙基铵(TEAPEt4NClO4)等适当的支持电解质，以导电性部件为作用电极，以铂(Pt)电极等贵金属电极、钛电极、碳类电极、不锈钢电极等不溶性电极为反电极，以饱和甘汞电极(SCE)、银-氯化银电极等为参比电极，进行2电极(作用电极-反电极)式的电解或3电极(作用电极-反电极-参比电极)式的恒定电位、恒定电流、可逆电位扫描、脉冲式的电解等，进行聚合，由此可以在导电性部件的表面上形成金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物聚合膜。
例如，该电解聚合优选使用如图1所示的3电极式电池，通过可逆电位扫描电解法等来进行。图1中，1为电池容器，2为导电性部件，3为反电极，4为参比电极、5为金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物溶液，6为恒电位仪(potentiostat)，7为X-Y记录器。
此外，使用高浓度的金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物溶液的情况下，例如，也可以使用如图2所示的2室型3电极式电池。图2中，1～7的意义与图1中的相同，8为电解质溶液，9为样品小瓶。
此外，考虑到生物体内测定、复合化测定、临床上的诊断、治疗等，制造简化的过氧化物阴离子用电极(针型电极)时，例如，也可以使用图3(A)和(B)所示的针型电极10和3电极式电池。图3中，1为电池容器，4为参比电极，5为金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物溶液，6为恒电位仪(potentiostat)，7为X-Y记录器、8为电解质溶液，9为样品小瓶、10为针型电极，11为反电极部分，12为导电部件端部(金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物聚合膜形成部分)，13为电绝缘性材料，14为反电极用配线。
对于该电极，如图3(C)所示，在经电绝缘材料13调制的细管中加入导电性部件，进一步用成为反电极的金属等材料覆盖该细管的外侧，制得反电极部分11。然后，通过在导电性部件端面12上形成金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物聚合膜，可以用作针型电极。
而且，对于金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜的厚度，虽然根据电极和金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的种类等来适当地决定，但是从电极活性、修饰稳定性等方面考虑，优选小于等于10μm。此外，优选其导电率大于等于10-3S/cm。
进一步地，基于去除不必要的生物体内电流、电流噪声等以及提高灵敏度、信号/噪声比(S/N比)等目的，对图3的简化过氧化物阴离子用电极(针型电极)进行改进而制造过氧化物阴离子用电极(改进的针型电极)时，也可以使用如图4(A)所示的改进的针型电极15和图3(A)所示的3电极式电池。图4中，11为反电极部分，12为导电部件端部(金属卟啉聚合膜形成部分)，13为电绝缘性材料，14为反电极用配线，15为改进的针型电极，16为接地部分，17为接地用配线。
对于该电极，如图4(B)所示，将导电性部件加入电绝缘性材料13中(2层结构)，将它们加入反电极用材料11中(3层结构)，进一步将它们加入电绝缘性材料13中(4层结构)，最后用成为接地的金属等材料覆盖该细管的外侧(5层结构)，制得接地部分16。通过在导电性部件端面12上形成金属卟啉聚合膜，可以用作改进后的简化的过氧化物阴离子用电极(改进的针型电极)。
而且，对于金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜的厚度，虽然根据电极和金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的种类来适当地决定，但是从电极活性、修饰稳定性等方面考虑，优选小于等于10μm。此外，其导电率优选大于等于10-3S/cm。而且，由于该改进的针型电极也用于复合化测定等，所以可以为直至10多层左右的多层结构。而且，作为接地的构成材料，虽然可以使用铂、金、银等贵金属；钛、不锈钢、铁-铬合金等耐腐蚀性合金；碳类等材料，但是由于接地大都进入生物体内，优选由安全性较高的材料(例如，铂、金、银等贵金属；钛；不锈钢；碳类等)等构成。
将本发明的电极用于过氧化物阴离子的测定，特别是其浓度的测定时，优选在该电极上组合①反电极和参比电极(3电极式)或②反电极(2电极式)。作为该反电极的构成材料，虽然可以使用铂、金、银等贵金属；钛、不锈钢、铁-铬合金等耐腐蚀性合金；碳类等材料，但是由于反电极大都进入生物体内，优选由安全性较高的材料(例如，铂、金、银等贵金属；钛；不锈钢；碳类等)等构成。
此外，作为参比电极，通常可以使用银/氯化银电极、汞/氯化汞等各种参比电极，此外，也可以使用固体的标准电极。进一步地，可以使用铂、金、银等贵金属；钛、不锈钢、铁-铬合金等耐腐蚀性合金；碳类等材料。
具体地说，能够用于过氧化物阴离子的测定用的测定装置的一个例子如图5所示。图5中的1、3、4、6和7的意义与图1中的相同，18为测定电极(作用电极)、19为微量注射器、20为测定溶液、21为磁力搅拌机、22为搅拌子。
此外，能够用于过氧化物阴离子测定用的测定装置的另一个例子如图6所示。图6中的1、6、7、19～22的意义与图4中的相同，10为针型电极。
本发明的过氧化物阴离子用电极可以在上述装置中用作用于检测过氧化物阴离子的电极，通过与①反电极和参比电极(3电极式)或②反电极(2电极式)一起使用，可以形成过氧化物阴离子浓度测定用的传感器。若在存在过氧化物阴离子自由基的测定体系中使用上述结构的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，则形成聚合膜的金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物中的金属被过氧化物阴离子自由基还原。例如，若该金属为铁，则被过氧化物阴离子自由基从Fe3+还原成Fe2+(式(7))。
然后，在将浓度测定电极电位(①3电极式时)或电压(②2电极式时)保持于能够氧化Fe2+的程度的状态下，将被过氧化物阴离子自由基还原的Fe2+再次电化学氧化(式(8))，若测定此时的所流的电流(氧化电流)，则由于该电流值与过氧化物阴离子自由基浓度相对应，所以可以由该氧化电流定量地检测溶解于样品溶液中的过氧化物阴离子自由基的浓度。即，通过与上式(5)和式(6)相同的原理，本发明的过氧化物阴离子用电极可以进行过氧化物阴离子自由基的浓度测定。
Por(Fe3+)+O2-·→Por(Fe2+)+O2……(7)Por(Fe2+)→Por(Fe3+)+e-……(8)(式(7)和式(8)中，“Por”指的是卟啉)本发明的过氧化物阴离子用电极，由于在导电性部件的表面上形成有金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜，所以与使用以往的金属卟啉聚合膜的电极相比，不易受到过氧化氢等致毒物质的影响，金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体的聚合膜的强度也大，能够耐受重复的使用。此外，由于使用电解聚合法等来进行成膜，所以与以往的电极相比，其调制也极其容易，可以得到特别是在生物体内易使用的形状诸如针状等。
如此，本发明的过氧化物阴离子用电极不必说在生物体外(in vitro)，即使在生物体内(in vivo)的环境下，也可以检测过氧化物阴离子自由基，通过与反电极或参比电极组合，可以定量地测定这些过氧化物阴离子，所以可以广泛用于各种领域。
即，在生物体内(in vivo)，例如，通过测定血液中的过氧化物阴离子的浓度，可以进行癌症等疾病的判定。
另一方面，即使在生物体外(in vitro)，通过测定食品内的过氧化物阴离子或其浓度，可以观察该食品的腐败状态。此外，通过测定自来水或废水等水中的过氧化物阴离子或其浓度，可以观察水质污染的状态。
进一步地，作为具有消除过氧化物阴离子自由基和该阴离子作用的酶，过氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase下文称为“SOD”)的浓度也可以通过测定加入含有SOD的样品时的过氧化物阴离子自由基的消除程度来测定。
通过本发明的过氧化物阴离子用电极，可以防止由于过氧化氢等致毒物质所导致中毒理由可能如下。
即，可能是由于，例如过氧化氢配位于作为活性中心的诸如铁等金属而使其中毒。与此相对地，作为轴向配体的咪唑类预先配位于铁的第五、六配齿处，将其占有，从而过氧化氢不能配位于铁上(铁的第一～第四配齿已被卟啉的吡咯配位)。如此，由于咪唑类等轴向配体配位于作为活性中心的铁上，抑制了过氧化氢的致毒，所以即使在过氧化氢的存在下，也能够稳定地测定过氧化物阴离子自由基。
实施例虽然下文举出参考例、实施例、比较例和试验例来对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限于此。
参考例1金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的合成(1)
将0.036g的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)溴化物和200μl的1-甲基咪唑溶解于1ml蒸馏二氯甲烷中，在室温下搅拌5小时。使用蒸发装置来将其蒸发干燥，得到[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物(收率为92％)。
UV(CHCl3，nm，λmax)419。
由于与无咪唑的配位化合物的吸收波长(λmax＝424nm)不同，所以可以确认到咪唑配位。此外，在磁圆偏振二色性光谱中，由于咪唑的配位，减小了580nm和600nm附近的偏振角，由此确认为六配位结构。
所使用的原料5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)溴化物的UV(紫外)光谱如图7所示。此外，产物[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物的UV光谱如图8所示。
参考例2金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的合成(2)将0.041g的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)溴化物和0.08g的1-苄基咪唑溶解于3ml蒸馏氯仿中，在室温下搅拌5小时。使用蒸发装置来将其蒸发干燥，得到[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)二(1-苄基咪唑基)]溴化物(收率为90％)。
UV(CHCl3，nm，λmax)418。
由于与无咪唑的配位化合物的吸收波长(λmax＝424nm)不同，可以确认到咪唑配位。
参考例3(1)将含有50ml丙酸、2.0ml的3-噻吩甲醛和1.4ml吡咯的溶液在不断搅拌下，在90℃下回流1小时。放冷至室温后，用冰冷却，将其滴入200ml的甲醇中。过滤沉淀物，用甲醇洗涤后，用硅胶柱色谱(展开溶剂氯仿)精制。从而以19％的收率得到产物5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉。
1H NMR(CDCl3，ppm)δ-2.7(s，2H)，7.7(t，4H)，8.0(m，8H)，8.9(s，8H)。
5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉的UV光谱如图9所示。
(2)然后，在10mL保持于严密的氮气氛围气下的氢溴酸(48％)中加入100mg还原铁，100℃下进行搅拌。将溶液蒸发干燥后，添加250mg的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉和200mL的二甲基甲酰胺，在氮气下搅拌4小时。在其中加入200mL氯仿，用离子交换水洗涤，进行脱水、蒸发干燥后，用氧化铝柱色谱(展开溶剂氯仿/甲醇＝20/1)精制。在洗脱液中加入48％的氢溴酸，进行脱水、蒸发干燥后进行重结晶，以54％的收率得到5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)溴化物。
UV(CHCl3，nm，λmax)424。
参考例4参考例3所示的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)溴化物合成法的改进在300ml圆底烧瓶中，取150ml丙酸，8.0ml的3-噻吩甲醛和5.6ml吡咯，搅拌该溶液的同时在160℃下回流1小时。放冷至室温后，添加200ml冷却至0℃的甲醇，通过抽滤回收生成的沉淀后，进行减压干燥(120℃，6小时)。将所得到的黑色粉末结晶溶解于氯仿中，过滤不溶部分后，通过硅胶柱色谱(展开溶剂氯仿)和重结晶进行精制。进行减压干燥后，以20％的收率得到黑紫色微晶形式的产物5，10，1 5，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉。
1H NMR(CDCl3，ppm)8-2.7(s，2H)，7.7(t，4H)，8.0(m，8H)，8.9(s，8H)。
然后，在保持于纯氩气氛围气下的500ml四口烧瓶中，导入6ml氢溴酸(48％)，加入200mg还原铁，搅拌的同时在90℃下使其反应。将溶液蒸发干燥后，纯氩气下在所得到的FeBr2中添加150ml二甲基甲酰胺，进一步加入150mg的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉，纯氩气下回流6小时(140℃)。蒸馏除去DMF后，添加200ml氯仿来进行溶解，用离子交换水洗涤，然后添加2滴氢溴酸，蒸馏除去溶剂后进行减压干燥(100℃，6小时)。以74％的收率得到产物5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)溴化物。
实施例1
过氧化物阴离子用电极的制造(1)用氧化铝抛光剂(0.05μm)对玻璃化炭黑(GC)电极(直径为1.0mm)进行抛光，将其用水洗涤后，进一步用甲醇洗涤。对于该电极的表面，使用下述电解溶液和操作顺序，通过电解聚合法制造在表面上形成有2分子咪唑配位于5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)的聚合膜的玻璃化炭黑电极(本发明品1)。
(样品溶液)作为金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物，以0.001M的浓度使用由参考例1合成的[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物。溶剂使用含有0.1M的高氯酸四丁基铵(Bu4NClO4/TBAP)为支持电解质的二氯甲烷(无水)。而且，通过氩气除去溶剂中的溶解氧。
(操作顺序)电解聚合通过图1所示结构的3电极式电池(作用电极GC，反电极Pt线，参比电极SCE)用可逆电位扫描电解法来进行。调制使用2分子咪唑配合于5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)的聚合膜的过氧化物阴离子用电极时，扫描范围对于SCE为0V～2.0V，调制使用2分子1-苄基咪唑配合于参考例2的5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)的聚合膜的过氧化物阴离子用电极时，扫描范围对于SCE为-0.2V～1.8V。此外，扫描速度都为0.05V/s，扫描次数在任意情况下都扫描15次。而且，该电解操作中所得到的循环伏安图(CV曲线)如图9和图10所示。
图10说明使用[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)二(咪唑基)]溴化物作为金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物来制造的电极(本发明品1)的电解聚合时的CV曲线。由该结果可知，在GC电极的表面上形成有金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物(2分子咪唑配位于5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)而形成的配位化合物)的聚合膜。
比较例1比较过氧化物阴离子用电极的制造
使用参考例3的不具有轴向配体的金属硫代呋喃基卟啉[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)溴化物]，以下，与参考例3同样地操作来调制金属硫代呋喃基卟啉聚合膜覆盖玻璃化炭黑电极(比较品1)。
试验例1过氧化物阴离子自由基量的测定试验使用本发明品1和比较品1的电极来进行过氧化物阴离子自由基量的测定。
首先，在电池容器中设置本发明品1或比较品1的电极作为作用电极，设置Pt线为反电极，使用银/氯化银电极(Ag/AgCl)作为参比电极，从而构成试验用3电极式电池。以该试验用3电极式电池为中心，准备如图5所示的装置。试验中，对于比较品1的电极，电位扫描范围设定为-0.2V～0.25V(对于Ag/AgCl)，对于本发明品1的电极，设定为-0.5V～0.5V(对于Ag/AgCl)。此外，在数种扫描速度下进行测定。
另一方面，调制含有14.4mM黄嘌呤的2mM氢氧化钾水溶液和含有10mM氯化钾的10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(pH为7.5)，分别取前者0.365ml，后者14.635ml，将它们混合，调制0.35mM黄嘌呤溶液作为测定溶液。用高纯度氩气除去该测定溶液中的溶解氧。
然后，将上述测定溶液加入各个试验用3电极式电池，施加充分高于各电极的氧化还原电位的电位，例如0.2V(对于Ag/AgCl)。在该测定溶液中，添加黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidaseXOD)至最后浓度为0mU/ml～100mU/ml，记录此时的氧化电流的随着时间推移的变化。本发明品1的结果如图12所示，比较品1的结果如图11所示。而且，XOD在使用前用10ml磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)透析。此外，测定都在室温下进行。
由该结果可知，对于比较品的电极，受到过氧化氢的阻碍电流的影响，过氧化物阴离子的检测电流迅速衰减，而对于聚合作为咪唑配位的配位化合物的[5，10，15，20-四(3-硫代呋喃基)卟啉合铁(III)二(1-甲基咪唑基)]溴化物而得到的电极，观测到恒定的检测电流。
产业上的可利用性本发明的过氧化物阴离子用电极由于不仅具有金属卟啉配位化合物的聚合膜的电极所具有的优异性能，还可以防止由于过氧化氢等致毒性物质所导致的中毒，所以即使在生物体外(in vitro)和生物体内(in vivo)的任意一种环境下，也可以不受过氧化氢等致毒物质的影响而检测过氧化物阴离子自由基。此外，由于通过与反电极或参比电极组合，可以定量地测定这些过氧化物阴离子，所以可以广泛用于各种领域。
因此，例如，通过在生物体内(in vivo)的使用，可以由生物体内的活性酶种或其它的自由基活性种判定各种疾病。
另一方面，通过在生物体外(in vitro)的使用，例如，通过测定食品内的过氧化物阴离子或其浓度，可以判断该食品的腐败状态。此外，通过测定自来水或废水等水中的过氧化物阴离子或其浓度，可以观察水质污染的状态。
权利要求
1.过氧化物阴离子用电极，其特征在于，在导电性部件的表面上形成有金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的电解聚合膜。
2.如权利要求1所述的过氧化物阴离子用电极，其中，所述金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物是下式(I)所示的化合物； 式中，M表示II价和III价之间的氧化还原电位比O2-·的氧化电位高而比水的氧化电位低的金属，4个R中的至少1个表示硫代呋喃基，2个L中的至少1个表示提供络合形成常数大于等于104M-2且稳定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的轴向配体。
3.如权利要求2所述的过氧化物阴离子用电极，其中，所述式(I)中，所述M为铁(III)或锰(III)。
4.如权利要求2或3所述的过氧化物阴离子用电极，其中，所述式(I)中，所述R为2-硫代呋喃基或3-硫代呋喃基。
5.如权利要求2所述的过氧化物阴离子用电极，其中，所述式(I)中，所述L为咪唑衍生物。
6.如权利要求5所述的过氧化物阴离子用电极，其中，所述咪唑衍生物是烷基咪唑或芳基烷基咪唑。
7.如权利要求1～6任意一项所述的过氧化物阴离子用电极，其中，所述金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的电解聚合膜的导电率大于等于10-3S/cm。
8.如权利要求1～7任意一项所述的过氧化物阴离子用电极，其中，所述电极的抗中毒性优异。
9.过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其含有由在导电性部件的表面上形成金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的聚合膜来形成的活性氧种用电极、反电极和参比电极。
10.如权利要求1所述的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其中，所述金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物是下式(I)所示的化合物； 式中，M表示II价和III价之间的氧化还原电位比O2-·的氧化电位高而比水的氧化电位低的金属，4个R中的至少1个表示硫代呋喃基，2个L中的至少1个表示提供络合形成常数大于等于104M-2且稳定的5配位配位化合物或6配位配位化合物的轴向配体。
11.如权利要求10所述的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其中，所述式(I)中，所述M为铁(III)或锰(III)。
12.如权利要求10或11所述的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其中，所述式(I)中，所述R为2-硫代呋喃基或3-硫代呋喃基。
13.如权利要求11所述的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其中，所述式(I)中，所述L为咪唑衍生物。
14.如权利要求13所述的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其中，所述咪唑衍生物是烷基咪唑或芳基烷基咪唑。
15.如权利要求9～14任意一项所述的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其中，所述金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物的电解聚合膜的导电率大于等于10-3S/cm。
16.如权利要求9～15任意一项所述的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，其中，所述传感器的抗中毒性优异。
17.样品中的过氧化物阴离子的检测方法，其特征在于，用权利要求9～16任意一项所述的传感器测定金属硫代呋喃基卟啉-轴向配体配位化合物聚合膜中的金属和过氧化物阴离子之间的氧化还原反应所产生的电流。
全文摘要
本发明提供过氧化物阴离子用电极和使用该电极的过氧化物阴离子浓度测定用传感器，所述过氧化物阴离子用电极的特征在于，在导电性部件的表面上形成有金属硫代呋喃基卟啉－轴向配体配位化合物的电解聚合膜。本发明的过氧化物阴离子用电极由于不仅具有金属卟啉配位化合物的聚合膜的电极所具有的优异性能，而且由于轴向配体的存在，还可以防止由于过氧化氢等致毒性物质所导致的中毒，所以即使在生物体外(in vitro)和生物体内(in vivo)的任意一种环境下，也可以不受过氧化氢等致毒物质的影响而检测过氧化物阴离子自由基。此外，通过与反电极或参比电极组合，可以定量地测定这些过氧化物阴离子，所以可以广泛用于各种领域。
文档编号G01N27/333GK1954206SQ20048004295
公开日2007年4月25日 申请日期2004年3月12日 优先权日2004年3月12日
发明者汤浅真, 小柳津研一, 山口有朋, 石川满寿英, 江口胜哉, 小林朋广, 筒井晓, 丰田裕次郎 申请人:汤浅真