专利名称：一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法。
背景技术：
自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团，它是线粒体在电子传递的 过程中产生的。在生命活动的代谢过程中不断产生各种自由基，包括超氧阴离子
(02—)、羟自由基('OH)、氢过氧基(H02、)、烷氧基(RO)、烷过氧基 (ROO)、过氧化氢(H202)、 一氧化氮(NO)等。羟基自由基是作用最强 的、重要的活性氧自由基。正常的生理条件下，自由基的产生以及抗氧化防御系 统之间存在动态平衡机制，对机体是有利的，当自由基的产生超出平衡机制，此 时机体产生氧化应激。研究表明，自由基的细胞毒性包括对脂类和细胞膜的损伤， 引发脂质过氧化，从而导致细胞坏死；对蛋白质、酶的损伤作用，引起蛋白过氧 化和一些功能酶的失活、变性；对遗传物质核酸和染色体的破坏，引起染色体畸 变，导致DNA双链断裂或形成加合物等。此外，近年的研究发现，自由基，如 NO，被认为是一类新发现的信号分子，通过与靶分子非共价结合引起靶分子空 间结构和活性的变化传递信号。
目前，自由基造成的线粒体损伤以及由此而引发的一系列机体健康问题己成 为生物医学领域研究的前沿。在环境科学领域，已有研究表明，污染物胁迫下生 物体自由基的产生及其氧化损伤可能是污染物致毒的重要路径。许多研究都观察 到活性氧自由基与污染物水平存在相关性，研究污染物胁迫下生物体自由基的产 生及其分子毒性作用机制，对于生态系统安全的早期预警及生态风险评价具有非 常重要的意义。自由基参与生命过程中许多重要的生化反应逐步为人们所认识， 特别是随着现代检测分析技术的日新月异，自由基在生物和病理学领域的作用研 究迅速发展。而寻求快速、准确、高效、直接的自由基检测方法己成为研究自由 基生物学作用的关键。
然而，由于活性氧自由基的寿命很短，并且在组织中存在的浓度极低，检测 较为困难。目前，常用的测定自由基的方法主要有化学发光法、高效液相色谱法、气相色谱法和荧光法等，但是这些测定方法大多是通过间接测定的方法。有些研
究者采用NBT还原法、细胞色素法、羟胺氧化等化学方法测定生物体的自由基， 但由于这些方法的干扰因素多，获得的结果不尽理想。如果能够直接测定生物体 内的自由基，对于预测污染生物体早期伤害将更有意义。
电子顺磁共振(EPR)结合自旋捕获技术是当前研究自由基最直接、最有效 的方法，近来已广泛应用于动物毒理、生物医学等领域的研究。此方法的基本原 理是利用捕获剂与活泼自由基反应形成较稳定的自由基，即自旋加合物，然后再 用EPR进行检测。目前比较常用的自旋捕捉剂有N氾，PBN等。NtB具有较快 的捕捉速率常数，其自旋加合物的波谱也比较确定，但此物质微溶于水，且对光 不稳定。PBN相对较稳定，自旋加合物寿命长。EPR结合自旋捕获技术提供了 大量重金属、有机物等化学品环境下老鼠、鱼类体内羟自由基的生成的依据，然 而至今，未有研究提供污染物胁迫下土壤生态系统生物活体体内活性氧产生的直 接证据。
蚯蚓作为土壤中生物量最大的动物类群之一，在土壤的物理、化学和生物过 程中扮演重要的角色。它们在有机质降解、营养循环和土壤形成中起重要作用。 蚯顿是生态系统中的重要物种并被广泛用做环境污染的生物指示者。有些敏感的 蚯蚓种属，如赤子爱胜蚓(Bs印/afef/'c/a)在毒理学实验中占据重要地位，它们 被广泛应用于土壤污染的环境评估，是标准毒理实验的典型生物。目前，关于蚯 蚓在各种不同污染物暴露胁迫下所产生的自由基对于机体所产生的氧化损伤的 研究较多，多使用抗氧化酶的响应或活性氧毒性作用终点产物的测定来推测机体 所受的氧化胁迫，而提供污染物胁迫诱导自由基产生的直接证据鲜见报道。
发明内容
1、 要解决的技术问题 本发明主要是针对现有自由基测定方法的不足，提供了一种测定蚯顿体内羟
基自由基的方法，采用EPR结合自旋捕获技术测定蚯蚓体内羟基自由基，可以 快速、准确、直接的进行自由基检测，为污染物胁迫诱导生物机体产生自由基提 供直接证据。
2、 技术方案一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法，包括如下几个步骤.-步骤(1)，蚯蚓清肠，清洗。
将经暴露的蚯蚓取出，放在铺有干净滤纸的烧杯中清肠6小时。 步骤(2)，自由基的PBN捕获。
将清肠后的蚯蚓取出放入冰生理盐水反复清洗，用滤纸吸干体表水分，迅速 称量0.1g蚯蚓置于玻璃匀浆器内，加入1mL 二甲基亚砜为溶剂配制的浓度为 50mmol/L的PBN溶液(加入过程中，避免水分进入，影响EPR波谱信号)， 冰浴条件下匀浆后，静置3-5min，待组织匀衆液出现有机相与水相的两相分层 后，取上层液40(VL注入直径为3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，准备进 行EPR测定。在捕获前半个小时，在密闭操作箱中导入氮气以彻底去除氧气， 以防产生甲氧基对结果进行干扰。以上整个操作过程在以导入氮气与氧气隔绝的 密闭操作箱中进行。整个过程应避免水分沾入。
步骤(3), EPR测定。
EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参 数测试温度(TE)室温，微波功率(SP) 20mW，微波频率(SF) 9.751GHz，调制 频率(MF) 100KHz，调制幅度(MA) 0.5G，中心磁场(CF) 3470G,扫场时间(TI) 84s，时间常数(TC)41ms，扫场宽度(SW) 200G，信号为5次叠加。 3、有益效果
本发明采用EPR结合自旋捕获技术，公开了一种测定蚯蚓体内自由基方法， 与以往的技术相比，本发明具有以下优点
(1) 快速、高效。本发明操作较为简单，容易掌握，并能在很短的时间内 测得蚯蚓的羟基自由基。
(2) 直接、准确。根据EPR波谱图的超精细结构参数可确定所测定的自 由基是羟基自由基，而不像化学法和色谱法那样专一性不强。
(3) 具有较好的剂量效应关系。研究结果显示自由基的强度与暴露物的浓 度存在着较好的剂量-效应关系，可以用来作为敏感的蚯蚓生物标志物。
(4) 实用性较广。本发明对其它蚯蚓属种也同样适用，对于不同的污染物 暴露都能直接测出羟基自由基，同时可应用于野外原位实验。
图1为Cd胁迫下蚯蚓体内自由基的信号图谱图2为Cd暴露浓度和羟基自由基的关系图3为TBBPA胁迫下蚯蚓体内自由基的信号图谱图4为TBBPA暴露浓度和羟基自由基的关系
具体实施例方式
以下通过实例进一步说明本发明的实施应用
实施例1重金属Cd胁迫下蚯蚓体内羟基自由基的测定
选择国际土壤生态毒理学研究的模式生物物种一赤子爱胜蚵(￡&eA7Zafetofa)，经过驯养一段时间后，选择体重0.3~0.4g，大小基本一致，具有成熟环带的健康成蚓，蚯蚓清肠24小时后，用超纯水在室温下反复冲洗蚯蚓2-3遍,用滤纸吸干蚯蚓体表水分。将蚯蚓暴露于不同浓度Cd污染的土壤中14天，Cd浓度为0， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0， 10.0mg/kg土壤，每个浓度组4个平行。暴露完成后将蚯蚓取出放入冰生理盐水反复清洗，迅速称量0.1g蚯蚓置于玻璃匀浆器内，加入1mL 二甲基亚砜为溶剂配制的浓度为50mmol/L的PBN溶液(加入过程中，避免水分进入，影响EPR波谱信号)，冰浴条件下匀浆后，静置3-5 min,待组织匀浆液出现有机相与水相的两相分层后，取上层液400pL注入直径为3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，准备进行EPR测定。整个操作过程在以导入氮气与氧气隔绝的密闭操作箱中进行。整个过程应避免水分沾入。
EPR测定使用Bmker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参数测试温度(TE)室温，微波功率(SP) 20mW，微波频率(SF) 9.751GHz，调制频率(MF) 100KHz，调制幅度(MA) 0.5G，中心磁场(CF) 3470G，扫场时间(TI)84s，时间常数(TC)41ms，扫场宽度(SW) 200G,信号为5次叠加。
图1是重金属Cd暴露后蚯蚓体内自由基信号变化的EPR波谱。说明蚯蚓经重金属Cd诱导可能产生自由基，被PBN捕获生成PBN-加合物，并且能被EPR光谱检测到。根据谱图的超精细结构常数和谱图的形状分析，在本实验中捕获到的活性氧是，OH。说明重金属Cd诱导蚯蚓产生了，OH。
从图2中可看出，重金属Cd诱导蚯蚓的，OH强度随着暴露的浓度增加而增加。当暴露浓度是0.5mg/kg时，OH的信号强度是对照组的150%，与对照组相比具有显著性差异(p句.05),当暴露浓度是5.0-10.0 mg/kg时，OH的信号强度是对照组的196%-266%,与对照组相比具有极显著性差异(p0.01)。线性回归分析表明，暴露浓度和产生的自由基强度之间呈明显的线性剂量-效应关系y=4.56*103x + 4.27*103， R2 = 0.927, y代表羟基自由基信号强度，x代表Cd暴露浓度。线性回归方程表明随着重金属Cd暴露浓度增加产生的自由基强度亦随之增加的线性模式，对蚯蚓可能产生了氧化损伤。
实施例2四溴双酚A (TBBPA)胁迫下蚯蚓体内羟基自由基的测定
选择国际土壤生态毒理学研究的模式生物物种一赤子爱胜蚓(Bsen/'afef/da),经过驯养一段时间后，选择体重0.3~0.4g，大小基本一致，具有成熟环带的健康成蚓，蚯弼腈肠24小时后，用超纯水在室温下反复冲洗蚯躬l 2-3遍，用滤纸吸干蚯蚓体表水分。将蚯蚓暴露于不同浓度TBBPA污染的土壤中14天，TBBPA浓度为0， 0.01， 0.05， 0.1， 0.5， 1.0mg/kg土壤，每个浓度组4个平行。暴露完成后将蚯蚓取出放入冰生理盐水反复清洗，迅速称量0.1g蚯蚓置于玻璃匀浆器内，加入1mL 二甲基亚砜为溶剂配制的浓度为50mmol/L的PBN溶液(加入过程中，避免水分进入，影响EPR波谱信号)，冰浴条件下匀浆后，静置3-5min，待组织匀浆液出现有机相与水相的两相分层后，取上层液40CVL注入直径为3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，准备进行EPR测定。整个操作过程在以导入氮气与氧气隔绝的密闭操作箱中进行。整个过程应避免水分沾入。
EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪。EPR操作参数测试温度(TE)室温，微波功率(SP) 20mW，微波频率(SF) 9.751GHz,调制频率(MF) 100KHz，调制幅度(MA) 0.5G，中心磁场(CF) 3470G，扫场时间(TI)84s，时间常数(TC)41ms，扫场宽度(SW) 200G,信号为5次叠加。
图3是TBBPA暴露后蚯蚓体内自由基信号变化的EPR波谱。说明蚯顿经TBBPA诱导可能产生自由基，被PBN捕获生成PBN-加合物，并且能被EPR光谱检测到。根据谱图的超精细结构常数和谱图的形状分析，在本实验中捕获到的活性氧是OH。说明TBBPA诱导蚯顿产生了，OH。
7从图4中可看出，TBBPA诱导蚯弼I的OH强度随着暴露的浓度增加而增加。 当暴露浓度是0.01mg/kg时，，OH的信号强度是对照组的109%,，与对照组相 比具有显著性差异(p《.05),当暴露浓度从0.05-1.0mg/kg时，*OH的信号强度 是对照组的123%-176%，与对照组相比具有显著性差异(p0.01)。线性回归分 析表明，暴露浓度和产生的自由基强度之间呈明显的线性剂量-效应关系y = 2.22*103x +3.9.5*103， R2= 0.859， y代表羟基自由基信号强度，x代表TBBPA 暴露浓度。线性回归方程表明随着TBBPA暴露浓度增加产生的自由基强度亦随 之增加的线性模式，对蚯顿可能产生了氧化损伤。
权利要求
1.一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法，包括如下几个步骤第一步；对充分暴露的蚯蚓体进行清肠，清洗；第二步自由基的PBN捕获；第二步EPR测定。
2. 根据权利要求1所述的一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法，其特征在于 在第二步自由基捕获前半个小时，在密闭操作箱中导入氮气以彻底去除氧气，以防产生甲氧基对结果进行干扰。
3. 根据权利要求2所述的一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法，其特征在于第 三步具体为清肠后的蚯蚓取出放入冰生理盐水反复清洗，用滤纸吸干体表 水分，迅速称量0.1g蚯蚓置于玻璃匀浆器内，加入1mL二甲基亚砜为溶剂 配制的浓度为50mmol/L的PBN溶液，冰浴条件下匀浆后，静置3-5 min， 待组织句浆液出现有机相与水相的两相分层后，取上层液400nL注入直径为 3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，准备进行EPR测定；以上整个搡作 过程在以导入氮气与氧气隔绝的密闭搡作箱中进行。整个过程应避免水分沾 入。
4. 根据权利要求1~3中任一项所述的一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法， 其特征在于EPR测定使用Bruker公司的EMX 10/12型电子顺磁共振仪， EPR操作参数测试温度(TE)室温，微波功率(SP) 20mW，微波频率(SF) 9.751GHz,调制频率(MF) 100KHz，调制幅度(MA) 0.5G,中心磁场(CF) 3470G,扫场时间(TI)84s,时间常数(TC) 41ms,扫场宽度(SW) 200G,信 号为5次叠加。
全文摘要
本发明公开了一种测定蚯蚓体内羟基自由基的方法。首先将充分暴露的蚯蚓清肠，清洗，在密闭的已经除氧的密闭操作箱中进行自由基的PBN捕获，最后用EPR技术进行测定。本发明的优点在于操作较为简单，容易掌握，并能在很短的时间内测得蚯蚓的羟基自由基；根据EPR谱图的超精细结构常数和谱图的形状分析，发现所测定的自由基是羟基自由基，是目前测定羟基自由基最直接、最准确有效的方法；具有较好的剂量效应关系。研究结果显示羟基自由基的强度与暴露物的浓度存在着较好的剂量-效应关系。
文档编号G01N24/10GK101639454SQ200910034260
公开日2010年2月3日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者可 吴, 姜锦林, 王晓蓉, 薛银刚, 顾雪元 申请人:南京大学