一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质组学的技术领域，具体涉及一种采用蛋白质组学测定急性肾损 伤患者尿液中生物标志物的方法。
【背景技术】
[0002] 急性肾损伤（acute kidney injury，AKI)是指病程在3个月以内的肾脏结构与功 能的异常（包括血、尿、组织学及影像学检查异常），它以肾小球滤过率迅速下降为特征，是 由不同病因导致的、具有不同临床表现的临床综合征。
[0003] 随着人口的老龄化，糖尿病、心血管疾病、造影剂肾病发病率的增加，近年来AKI 的发生率明显增加。尽管对AKI的认识不断深入，支持和辅助的治疗措施也有不断进展，但 AKI的预后仍差，死亡率居高不下。改善AKI预后的关键是早期诊断，早期干预。
[0004] 目前AKI的诊断标准为：肾功能在48h内突然减退，表现为至少两次血清肌酐升高 的绝对值彡26. 5 μ mol/L ;或血清肌酐较基础值升高彡50% ;或尿量〈0. 5mV (kg · h)，时间 超过6h (排除梗阻性肾病或脱水状态）。
[0005] 由此可见，目前对AKI的诊断仍基于血清肌酐和尿量的测定，但它们并不能在早 期反映肾小球滤过率（glomerular filtration rate, GFR)的下降，且受到众多外在因素的 影响。因此以肌酐测定为基础的肾功能评价体系阻碍了 AKI治疗的进展，需要用更加敏感、 特异的方法测定肾功能的下降。
[0006] 理想的AKI生物标志物最好具备如下特点：（1)检测标本容易获得，无创，易于在 床边或临床标准实验室进行，快速、方便、测定费用低廉；（2)对AKI高度敏感，能早期发现 和诊断AKI ; (3)具有较宽的动态范围和诊断阈值，便于统计学分析；(4)能鉴别损伤部位 (近端肾小管、远端肾小管、肾间质或肾血管）；（5)能评价肾脏损伤的持续时间（AKI、慢性 肾脏病或慢性肾衰急性加重）；(6)能鉴别AKI的病因（缺血、中毒、混合型）；（7)能定义 AKI的病程以及监测对AKI干预的临床效果；(8)在探索新药治疗AKI方面发挥关键作用。
[0007] 近年来，随着功能性基因组学和蛋白质组学的发展，研宄人员从血液或尿液样本 中逐渐筛选出一些有临床应用前景的AKI新型生物标志物，这些新的标志物不仅能在血 清肌酐升高之前诊断AKI，而且能为AKI的病因诊断提供帮助。2014年由Azra Bihorac 和Lakhmir S Chawla等于Am J Resp Crit Care杂志上最新发表的文献《Validation of cell-cycle arrest biomarkers for acute kidney injury using clinical adjudication》报道确定了急性肾损伤的两个新标志物。同时，该研宄小组验证了这两 个新的标志物：尿中的金属蛋白酶组织抑制物（??ΜΡ)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白 7 (IGFBP7)，当用这两个指标一起评估时，就能便于临床医生在现行标准指示疾病发生之前 检测和治疗AKI。
[0008] 目前，关于金属蛋白酶组织抑制物（??ΜΡ)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白 7 (IGFBP7)的准确定量检测手段并没有完整和确定的方法，因此，为了让这两个指标能够尽 早的应用于诊断，辅助临床医生对急性肾损伤的诊断，需要开发一种方法对这两种物质进 行准确的定量，为后续的研宄和临床应用提供一种检测方法。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是，建立一种可以同时测定尿液样本中金属蛋白酶组织 抑制物-2 0?ΜΡ-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)生物质谱相对定量方法。 [0010] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0011] 一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，分别将病人组和正常组的 尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生 物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合 蛋白7的相对定量。
[0012] 进一步地，所述尿液样本酶解得到多肽片段溶液的步骤包括：样本干燥与复溶、蛋 白提取与复溶定量、样本酶切和样本脱盐。
[0013] 进一步地，所述样本干燥与复溶方法为：收集正常人和急性肾损伤病人的尿液样 本进行真空冷冻干燥处理，将冷冻干燥得到的尿液样本用超纯水进行复溶。
[0014] 进一步地，所述蛋白提取与复溶定量方法为：将复溶的尿液样本用3-5倍体积的 丙酮进行蛋白沉淀，将丙酮沉淀得到的蛋白用超纯水复溶，得到蛋白溶液，然后用Bradford 方法初步定量样本中蛋白的含量。
[0015] 进一步地，所述样本酶切方法为：向定量后的蛋白溶液中加入400uL50mM的碳酸 氢铵溶液，再加入20uL 0. 5mg/mL的胰酶溶液，混匀，于37°C孵育12-16小时，得到多肽片段 溶液。
[0016] 进一步地，所述样本脱盐方法为：首先用100%甲醇平衡C18柱lmin，然后将酶切 得到的多肽片段溶液注入C18柱中，用超纯水洗脱C18柱2次，然后用80 %的乙腈溶液洗脱 C18柱，收集洗脱流出液，得到多肽片段溶液。
[0017] 进一步地，所述液相色谱-串联质谱分析中，液相色谱条件为：色谱柱：peptide C18柱，50mmX2. Imm I. D.，5um粒径；流动相：甲酸体积百分数占0· 1%的水和甲酸体积百 分数占0. 1%的乙腈，梯度洗脱；柱温40°C ;流速500 μ Ι/min ;进样量20uL ;所述的梯度洗 脱程序如下表所示：
[0018]
【主权项】
1. 一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，其特征在于；分别将病人组 和正常组的尿液样本酶解得到多肤片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肤片段溶液， 然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和膜岛素样生 长因子结合蛋白7的相对定量。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于；所述尿液样本酶解得到多肤片段溶液的步 骤包括：样本干燥与复溶、蛋白提取与复溶定量、样本酶切和样本脱盐。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述样本干燥与复溶方法为；收集正常人和 急性肾损伤病人的尿液样本进行真空冷冻干燥处理，将冷冻干燥得到的尿液样本用超纯水 进行复溶。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于；所述蛋白提取与复溶定量方法为；将复溶的 尿液样本用3-5倍体积的丙酬进行蛋白沉淀，将丙酬沉淀得到的蛋白用超纯水复溶，得到 蛋白溶液，然后用化a壯ord方法初步定量样本中蛋白的含量。
5. 如权利要2所述的方法，其特征在于：所述样本酶切方法为；向定量后的蛋白溶液 中加入400uL50mM的碳酸氨锭溶液，再加入20uL0. 5mg/血的膜酶溶液，混匀，于37°C解育 12-16小时，得到多肤片段溶液。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述样本脱盐方法为；首先用100%甲醇平 衡C18柱Imin，然后将酶切得到的多肤片段溶液注入C18柱中，用超纯水洗脱C18柱2次， 然后用80%的己膳溶液洗脱C18柱，收集洗脱流出液，得到多肤片段溶液。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述液相色谱-串联质谱分析中，液相 色谱条件为；色谱柱；P巧tideC18柱，50mmX2. 1mmI.D.，5um粒径；流动相；甲酸体积百分 数占0. 1%的水和甲酸体积百分数占0. 1%的己膳，梯度洗脱；柱温40°C;流速500y1/min; 进样量20uL;所述的梯度洗脱程序如下表所示：
其中A是甲酸体积百分数占0. 1%的水溶液，B是甲酸体积百分数占0. 1%的己膳混合 溶液； 质谱条件为；四级杆飞行时间液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和数据处 理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压23000V;温度500°C;源 内气体1;氮气压力15psi;源内气体2;氮气压力化si;气帘气体；氮气压力30psi;扫描方 式为多重反应监测。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的生物信息分析方法为：用ProteinPilot做数据检索，同时用skyline做非标记定量，根据数据检索和分析的结果计 算出样本中金属蛋白酶组织抑制物和膜岛素样生长因子结合蛋白7的相对含量。
【专利摘要】本发明公开了一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，采用的技术方案是：将尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量。本发明的相对定量方法具有通量高、灵敏度高、重现性好等特点。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104792900
【申请号】CN201510224878
【发明人】华权高, 沈鹤霄
【申请人】武汉华美生物工程有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月6日