一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测依诺肝素钠中1，6酐含量的不含肝素酶I的肝素酶组 合物及其应用与其检测方法，属于医药生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 依诺肝素钠 （Enoxaparin Sodium，ES)是一种低分子肝素钠盐，由猪肠粘膜肝素苄 基酯衍生物进行碱解聚而获得，美国专利US005389618A详述了这种依诺肝素钠制备过程。 美国药典和欧洲药典等对于依诺肝素钠的质量控制有着诸多要求，除了对效价、分子量分 布、重金属含量和试剂残留含量等理化项目检测外，还要求测定1，6-酐含量。由于1，6-酐 环结构低聚糖链的百分数是依诺肝素钠低聚糖混合物的特征，药典中规定其1，6-酐环结 构需占全部糖单元的15% -25%。基于依诺肝素钠的结构与组成的高度复杂性，目前常规 的检测尚难以涉及其分子的细节结构，在结构确证与质量标准控制上存在一定的不确定 性。
[0003] 美国药典描述了一种1，6_酐含量测定方法（USP32附录〈207> "依诺肝素钠的 1，6-酐衍生物检查")，是利用三种肝素酶等量混合，酶解依诺肝素钠样品两天，产物再经还 原后HPLC分析。但实际应用中按此方法进行，其结果往往不能符合标准，主要原因在于肝 素酶性质特别，往往酶解过程无法完成彻底，使得样品性能不能判断。特别是肝素酶I不稳 定，价格高，选择性差，不同来源的肝素酶对1，6-酐含量测定方法影响很大。所以导致该方 法的稳定性差，重复性差，至今该方法只是一个一般检测方法，而没有作为依诺肝素的质检 放行方法。
【发明内容】
[0004] 鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种可彻底特异性酶解依诺 肝素钠的肝素酶组合物及其检测方法。
[0005] 本发明的目的，将通过以下技术方案得以实现：
[0006] -种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物，所述肝素酶组合物为肝素酶 Π 与肝素酶III的混合物，所述肝素酶II :肝素酶III的酶量活性比为3:1。
[0007] 优选地，所述肝素酶II与肝素酶III为酶溶液或冻干酶粉。
[0008] 优选地，所述肝素酶组合物用于依诺肝素钠的特异性酶解还原制得1，6-酐衍生 物。
[0009] 优选地，所述肝素酶组合物酶解还原制得1，6-酐衍生物包括如下步骤，
[0010] S1，完全酶解依诺肝素钠步骤，在待酶解的依诺肝素钠溶液中加入肝酶素组合物， 置于室温下酶解至少24小时；
[0011] S2,还原酶解后样品步骤，在经过酶解后的样品中添加硼氢化钠溶液涡旋混合进 行室温的还原，并经过滤膜的过滤；
[0012] S3,还原产物的HPLC检测，对S2中的还原产物按照以下色谱条件进行检测：
[0013]
【主权项】
1. 一种可彻底特异性酶解依诺肝素钢的肝素酶组合物，其特征在于：所述肝素酶组合 物为肝素酶II与肝素酶III的混合物，所述肝素酶II;肝素酶III的酶量活性比为3:1。
2. 如权利要求1所述一种可彻底特异性酶解依诺肝素钢的肝素酶组合物，其特征在 于；所述肝素酶II与肝素酶III为酶溶液或冻干酶粉。
3. 如权利要求1所述一种可彻底特异性酶解依诺肝素钢的肝素酶组合物的应用，其特 征在于：所述肝素酶组合物用于依诺肝素钢的特异性酶解还原制得1,6-酢衍生物。
4. 如权利要求3所述一种可彻底特异性酶解依诺肝素钢的肝素酶组合物的应用，其特 征在于：所述肝素酶组合物酶解还原制得1,6-酢衍生物包括如下步骤， S1，完全酶解依诺肝素钢步骤，在待酶解的依诺肝素钢溶液中加入肝酶素组合物，置于 室温下酶解至少24小时； 52, 还原酶解后样品步骤，在经过酶解后的样品中添加棚氨化钢溶液祸旋混合进行室 温的还原，并经过滤膜的过滤； 53, 还原产物的HPLC检测，对S2中的还原产物按照W下色谱条件进行检测：
54, 分析图谱得出糖单元种类和含量； 根据色谱图的分离度，得出洗脱还原产物为1，6-酢衍生物，并按照公式计算还原产物 中1，6-酢摩尔百分含量，1，6-酢摩尔百分含量为
S种主要的1，6-酢衍生物的摩尔百分含量的计算，S种所述1，6-酢衍生物分别 包括 4# 峰l,6-anhyho_IIS与l,6-anhy^o_IISeP\9# 峰l,6-anhy^o_IS和 11# 峰 1，6-anhy化0-IS-ISepi; 其中Mw;依诺肝素钢平均分子量；Mwx;各个衍生物X的相对分子量；Ax;各个衍生 物X的峰面积；A1 ;1，6-AnhydroAIs的峰面积；A2 ;1，6-AnhydroAIIs的峰面积；A3 ; 1. 6-AnhydroAIs-Is的峰面积 S5,判断1，6-酢衍生物中1，6-酢含量是否合格；当1，6-酢衍生物中1，6-酢含量的摩 尔百分含量结果在15-25%范围内，则判定为合格，否则即判定为不合格。
【专利摘要】本发明提供了一种可彻底特异性酶解依诺肝素钠的肝素酶组合物，所述肝素酶组合物为肝素酶Ⅱ与肝素酶Ⅲ的混合物，所述肝素酶Ⅱ：肝素酶Ⅲ的酶量活性比为3:1。通过本发明的肝素酶组合物可以彻底的酶解依诺肝素钠形成并经还原制得1,6-酐衍生物，且含量均在合格范围，本发明的肝素酶组合物不用肝素酶I减少了酶杂质的引入，使方法更可靠，是对几大药典方法的重要补充，具有很高的实际使用价值和意义。
【IPC分类】G01N30-02, G01N3-06
【公开号】CN104792896
【申请号】CN201510197244
【发明人】金永生, 姚亦明, 王宁霞, 王林林, 闫倩倩
【申请人】苏州融析生物科技有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月23日