专利名称：一种反义寡聚核苷酸－碳纳米管药物载体的制作方法
技术领域：
本发明属制药技术领域，特别是涉及一种寡聚核苷酸与纳米材料组成的药物载体及其制备方法和应用。
背景技术：
选择合适的靶基因作为攻击点和合适的载体来提高药物在生物体内的表达是肿瘤治疗研究中遇到的两大课题。然而，近20年来在肿瘤分子生物学特征方面和生物相容性化学材料方面取得的进展为靶基因的选择打下了良好的基础。
人类端粒是位于染色体末端的重复DNA序列(TTAGGG)，具有维持染色体稳定的重要作用，端粒长短变化和稳定与细胞的衰老和癌变密切相关。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白聚合酶，它能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，弥补端粒丢失，对维持端粒长度，使细胞获得永生化起重要作用。根据目前已检测的癌组织标本的统计结果分析，恶性肿瘤组织端粒酶检出率高达84％~95％，而良性肿瘤及正常组织的端粒酶检出率仅4％左右，表明端粒酶是肿瘤生长所必需而不存在于正常组织的细胞成分，因此端粒酶与肿瘤之间的高度相关性使之成为治疗肿瘤的理想靶点，是目前肿瘤基因治疗研究的新热点。
端粒酶有3个主要组成部分端粒酶RNA(hTR)、端粒相关蛋白(TP1)、端粒酶催化亚单位(hTERT)。端粒酶催化亚单位(hTERT)是一个最近才被克隆出来的单拷贝基因，其基因组合有逆转录酶催化区域的高度保守的特异序列。现已证明hTERT mRNA只在恶性肿瘤组织或肿瘤细胞株以及某些有高度再生潜力的自我更新组织(如子宫内膜)中表达，与端粒酶活性表达一致，对癌病变特异，其上游调节对端粒酶活性表达起重要作用，被认为是端粒酶活性的限速决定因素。
反义技术概念是Lzant等于1984年首次提出的，其基本原理就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段以抑制或封闭专一靶基因表达的技术。
反义寡聚核苷酸(ASODN)是指能够特异性抑制一个基因的转录或翻译的短小DNA片段。反义核酸治疗则是利用反义技术设计与异常激活或有害基因及其mRNA互补的反义寡聚核苷酸，特异性地封闭那些基因抑制其表达，从而达到减少基因产物，抑制细胞恶变的作用。
碳纳米管(CNTs)自1991年被发现以来，因其独特的性质成为世界范围内的研究热点之一。纳米材料在生物领域方向的研究以零维的纳米颗粒为多，碳纳米管作为一种具有良好生物相容性的一维纳米材料在生物领域的应用则很少有报道。
一维碳纳米管在空间有两维处于纳米尺度。根据碳纳米管中碳原子层数的不同，碳纳米管大致可以分为两类单壁碳纳米管(SWNTs)和多壁碳纳米管(MWNTs)。SWNTs是由单层碳原子绕合而成的，结构具有较好的对称性和单一性。MWNTs是由许多柱状碳管同轴套构而成。
与传统的零维纳米颗粒相比，碳纳米管在药物载体上的应用具有如下特点碳纳米管特别是功能化的碳纳米管具有良好的生物相容性，对生物体系毒性小，这为将碳纳米管应用到生物领域提供了可能；管状结构的碳纳米管具有很高比表面积，在其壁表面修饰生物体系可以提高负载量；碳纳米管通过简单的化学处理将其打断成任意长度，适用于生物领域的应用；碳纳米管通过简单的化学修饰使其壁表面带上亲水性的官能团，得到在水溶液中均匀分散的碳纳米管溶液体系；通过化学修饰可以使碳纳米管管壁带有不同功能的官能团，适于不同生物体系的研究。但是，目前尚未见到利用多壁碳纳米管作为药物载体，来提高反义寡聚核苷酸在肿瘤细胞中的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长，达到促进肿瘤细胞调亡的目的的报道。
发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，有效提高反义寡聚核苷酸的负载量和靶向性，以克服单独使用反义寡聚核苷酸药物转染率低、抑制肿瘤细胞效果不明显等缺点。填补了以碳纳米管为载体来输送靶向性生物分子或药物的空白。
技术方案本发明的技术方案之一是提供一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，由碳纳米管外壳和反义寡聚核苷酸组成。
上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的优选方案之一为，所说的反义寡聚核苷酸为端粒酶催化亚单位基因的反义寡聚核苷。
上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的优选方案之二为，所说的碳纳米管长度为50~200nm，直径为10~50nm。
本发明的技术方案之二是提供上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法，依次包括如下步骤
a)用强酸氧化多壁碳纳米管，使多壁碳纳米管管壁带上羧基，超声裁剪成50~200nm的短管；b)加入聚阳离子化合物修饰到碳纳米管管壁上；c)将反义寡聚核苷酸组装到多壁碳纳米管上。
上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法的优选方案之一为，所说的强酸为浓硫酸、浓硝酸、浓盐酸或者其混合物。
上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法的优选方案之二为，所说的聚阳离子化合物选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚铵、聚酰胺胺树枝状化合物或壳聚糖中的一种或一种以上。
上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法的优选方案之三为，所说的反义寡聚核苷酸为端粒酶催化亚单位基因的反义寡聚核苷。
本发明的技术方案之三是提供上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的应用，包括将负载有端粒酶催化亚单位基因反义寡聚核苷的碳纳米管作用于肿瘤细胞。优选方案为，所说的肿瘤细胞为宫颈癌细胞。
本发明的技术方案之四是提供一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物，由有效剂量的上述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体和药学上可接受的其他成分组成。
实现本发明的药物载体的具体制备技术步骤如下(1)用浓硫酸和浓硝酸的混合物氧化多壁碳纳米管，使多壁碳纳米管管壁带上羧基(-COOH)。通过超声将之裁剪成50~200nm的短管。
(2)利用基团之间的静电作用力将聚阳离子化合物聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)，或聚乙烯亚铵(PEI)，或聚酰胺胺(PAMAM)树枝状化合物，或壳聚糖(Chitosan)等修饰到碳纳米管管壁上，得到在水溶液中均匀分散的多壁碳纳米管体系。
(3)利用基团之间的静电作用力将ASODN组装到多壁碳纳米管上，得到了负载有hTERT基因反义寡聚核苷酸的多壁碳纳米管体系。
(4)将负载有hTERT基因反义寡聚核苷的碳纳米管加入到对数生长期的Hela细胞中，继续培养24h后，用流式细胞仪检测其转染效率及hTERT基因反义寡聚核苷对宫颈癌细胞的抑制效率。
本发明的碳纳米管作为药物载体，可以选用不同种类的寡聚核苷酸序列作为起药物作用的成分，比如基因组DNA序列、cDNA、质粒载体、DNA疫苗、干扰RNA、核酸酶等等，而不影响本发明的技术构思和相应的技术效果，所以在本发明的说明书中，均以hTERT基因反义寡聚核苷酸为例，并不意味着本发明的技术方案仅能够用于hTERT基因反义寡聚核苷酸。
有益效果本发明利用多壁碳纳米管作为药物载体，来提高反义寡聚核苷酸在肿瘤细胞中的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长，达到促进肿瘤细胞调亡的目的。
本发明所提供的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，比传统的零维纳米颗粒更加有效地携带反义寡聚核苷酸，与单独使用裸反义寡聚核苷酸药物相比对靶细胞转染率高、靶向性强、抑制肿瘤细胞效果明显。填补了以碳纳米管为载体来输送靶向性生物分子或药物的空白。该药物载体制备方法简单、快速、价廉、易于工业化生产。针对不同的生物体系，以碳纳米管为载体来输送不同的靶向性生物分子或药物，如基因组DNA序列、cDNA、质粒载体、DNA疫苗、干扰RNA、核酸酶等，为其它肿瘤或疾病的治疗尝试了一条新的途径。
下面结合附图对理解本发明做进一步详细描述，但并非对本发明做限定。
图1.反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备示意图。聚阳离子采用聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)，或壳聚糖(Chitosan)，或聚乙烯亚铵(PEI)，或聚酰胺胺(PAMAM)树枝状化合物。
图2.酸化后的多壁碳纳米管(MWNTs)红外光谱。1712cm-1是羧基的吸收带。
图3.TEM图。A)未经过处理的MWNTs；B)经过混酸氧化超声16h的MWNTs。
图4.HeLa细胞中MWNTs-PEI-ASODN和裸反义寡聚核苷酸的转染率的比较。细胞经洗涤后用流式细胞仪进行分析的结果。
图5.HeLa细胞分别经MWNTs-PEI-ASODN和裸反义寡聚核苷酸处理24小时后的调亡百分数比较。细胞经洗涤后用PI处理，经流式细胞仪分析的结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。常规无机化学试剂和有机溶剂购自上海化学试剂厂，聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、聚乙烯亚铵(PEI)、聚酰胺胺(PAMAM)树枝状化合物购自Aldrich，壳聚糖(Chitosan)购自上海生化试剂公司。
下列实施例中的反义寡聚核苷酸是根据人类端粒酶催化亚单位(hTERT)基因cDNA的序列分析，选择了起始密码子上游的9个碱基及后续的11个碱基，共20个碱基作为作用的靶序列，设计出的反义寡聚核苷酸的序列。其核苷酸序列为5’-GGAGCGCGCGGCATCGCGGG-3’，上述反义寡聚核苷酸序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
本发明的碳纳米管作为药物载体，可以选用不同种类的寡聚核苷酸序列作为起药物作用的成分，比如基因组DNA序列、cDNA、质粒载体、DNA疫苗、干扰RNA、核酸酶等等，而不影响本发明的技术构思和相应的技术效果，所以在下列实施例中，以hTERT基因反义寡聚核苷酸为例，并不意味着本发明的技术方案仅能够用于hTERT基因反义寡聚核苷酸。
实施例11.酸化MWNTs的制备将MWNTs置于混酸之中(H2SO4与HNO3的体积比为3∶1)，超声16小时。用100nm微孔滤膜过滤所得MWNTs悬浮液，用二次蒸馏水多次漂洗直至中性。将其重新分散到二次蒸馏水中，多次离心过滤(7000rpm，5min)除去其中的大颗粒MWNTs，得到长度分布在100-300nm之间且管壁上修饰有-COOH的MWNTs(红外光谱图2，TEM图3)。
2.PEI-MWNTs水相体系的制备制备原理利用基团之间的静电作用力。
将0.5mgMWNTs与5ml 1％聚乙烯亚铵(PEI)混合。超声15min，用200nm微孔滤膜过滤所得到的混合物，除去多余的未反应的PEI后，分散到pH＝7.2的PBS中，得到稳定的PEI-MWNTs水相体系。灭菌待用。
除了聚乙烯亚铵(PEI)之外，聚阳离子化合物也可以采用聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚酰胺胺树枝状化合物或壳聚糖，还可以使用聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚铵、聚酰胺胺树枝状化合物和壳聚糖的两两组合，或者两种以上的组合，其制备过程相同。
3.hTERT基因反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备制备原理利用基团之间的静电作用力。
将ASODN分散到pH＝7.2的PBS中，其终浓度为10μM。取30μl ASODN溶液加入到25μl 0.1mg/ml的PEI-MWNTs水相体系中，静置30min，离心过滤(7000rpm，5min)，除去多余的ASODN后，重新分散到pH＝7.2的PBS中，得到稳定的MWNTs-PEI-ASODN水相体系。
4.Hela细胞的培养Hela宫颈癌细胞株购自中科院上海细胞库.Hela细胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，37℃5％CO2饱和温度下培养。实验选用对数生长期细胞。
5.细胞转染率的测定将ASODN、MWNTs-PEI-ASODN分别加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO2饱和温度下培养24h。取未经任何处理的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照。胰酶消化后，用70％的乙醇固定用流式细胞仪分别检测他们的转染率。从图4可以看出，与纯的ASODN相比，MWNTs-PEI提高了ASODN的转染率。说明功能化MWNTs可以作为一种很好的药物载体应用于生物领域。
6.细胞调亡率的测定将ASODN、MWNTs-PEI-ASODN分别加入到对数生长期的Hela细胞中，在37℃5％CO2饱和温度下培养24h。取的对数生长期的Hela细胞，作为阴性对照。胰酶消化后，用70％的乙醇固定。经PI染色后，用流式细胞仪分别检测他们的凋亡率。从图5可以看出，与未经任何处理的Hela细胞相比，经ASODN作用的Hela细胞出现了明显的凋亡现象。说明ASODN是一种很好的治疗宫颈癌的药物。与纯的ASODN相比，经MWNTs-PEI-ASODN作用的Hela细胞呈现出更高的凋亡率，这是因为MWNTs-PEI增加了ASODN在Hela细胞中的表达，进一步说明了功能化的MMNTs是一种有效的药物载体。
权利要求
1.一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，由碳纳米管外壳和反义寡聚核苷酸组成。
2.根据权利要求1所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，其特征在于，所说的反义寡聚核苷酸为端粒酶催化亚单位基因的反义寡聚核苷。
3.根据权利要求1所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体，其特征在于，所说的碳纳米管长度为50~200nm，直径为10~50nm。
4.权利要求1所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法，依次包括如下步骤a)用强酸氧化碳纳米管，使管壁带上羧基，超声裁剪成50~200nm的短管；b)加入聚阳离子化合物修饰到碳纳米管管壁上；c)将反义寡聚核苷酸组装到碳纳米管上。
5.根据权利要求4所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法，其特征在于，所说的强酸为浓硫酸、浓硝酸、浓盐酸或者其混合物。
6.根据权利要求4所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法，其特征在于，所说的聚阳离子化合物选自聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚铵、聚酰胺胺树枝状化合物或壳聚糖中的一种或一种以上。
7.根据权利要求4所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的制备方法，其特征在于，所说的反义寡聚核苷酸为端粒酶催化亚单位基因的反义寡聚核苷。
8.权利要求1所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的应用，包括将负载有端粒酶催化亚单位基因反义寡聚核苷的碳纳米管作用于肿瘤细胞。
9.根据权利要求1所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体的应用，其特征在于，所说的肿瘤细胞为宫颈癌细胞。
10.一种反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物，由有效剂量的权利要求1所述的反义寡聚核苷酸-碳纳米管药物载体和药学上可接受的其他成分组成。
全文摘要
本发明涉及一种反义寡聚核苷酸－碳纳米管药物载体，由碳纳米管外壳和反义寡聚核苷酸组成。采用强酸氧化多壁碳纳米管，使管壁带上羧基，经超声裁剪成长50~200nm，直径为10~50nm的短管；加入聚阳离子化合物修饰到碳纳米管管壁上；将反义寡聚核苷酸组装到多壁碳纳米管上。该制备方法简单、快速。该药物载体具有转染率高、靶向性强、抑制肿瘤细胞效果明显等特点。针对不同的生物体系以碳纳米管为载体来输送不同的靶向性生物分子或药物，可应用于肿瘤或基因疾病的治疗。
文档编号A61K47/02GK101015696SQ20071003758
公开日2007年8月15日 申请日期2007年2月15日 优先权日2007年2月15日
发明者贾能勤, 连琼 申请人:上海师范大学