专利名称：一种基于寡聚核苷酸-非标记的纳米金检测三聚氰胺的方法
技术领域：
本发明涉及生物学、医学、食品学、化学等学科的交叉学科领域。更具体涉及一种
基于寡聚核苷酸-非标记的纳米金检测三聚氰胺的方法。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine)对人和动物造成的危害已引起人们的广泛关注，液态奶及 奶粉的假蛋白事件主要是由于一些不法人员在牛奶或奶粉中添加三聚氰胺，提高奶制品的 含氮量，以此冒充蛋白质。然而三聚氰胺进入人体后，发生取代反应(水解)，生成三聚氰 酸，三聚氰酸和三聚氰胺形成大的网状结构，并与尿液形成难溶性盐造成结石，对健康构成 严重威胁。2008年10月7日卫生部、工信部、农业部、国家工商总局以及国家质检总局联合 发布《关于乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值规定的公告》，公告规定婴幼儿配方乳 粉中三聚氰胺的限量值为lmg/kg;液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉中三聚氰胺 的限量值为2. 5mg/kg。目前三聚氰胺的检测方法主要有液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质 谱法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等。但上述检测方法均需使用大型仪器，操作 繁琐，费时费力，成本高，无法在原料及产品现场直接对三聚氰胺进行快速检测。
纳米金颗粒的分散与团聚状态有明显的颜色变化，这一现象近年来已被广泛应 用于蛋白质、DNA等的比色法检测中，以纳米金为探针检测三聚氰胺的方法正是建立在 此原理的基础上。虽然前不久有人利用此原理报道了一个相似的检测方法(Kelong Ai， Yanlan Liu，and Lehui Ui，Journal of the American ChemicalSociety 2009,131(27)， 9496-9497.)，但他们报道的方法不仅需要用巯基试剂标记纳米金，且该试剂没有商品化， 需要自己合成，不仅劳动强度大，费时费力，且其纯度直接影响检测灵敏度和选择性。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种基于寡聚核苷酸_非标记的纳米金检测三聚氰 胺的方法，以纳米金为探针检测三聚氰胺，简便快速，灵敏度高，选择性好，成本低，无需大 型仪器设备即可达到国家关于乳与乳制品中三聚氰胺临时管理限量值规定的要求，可实现 原料及产品中三聚氰胺的快速检测。 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施 —种基于寡聚核苷酸_非标记的纳米金检测三聚氰胺的方法，其步骤如下
1)纳米金的合成以氯金酸(HAuCl4 *4H20)、拧檬酸三钠、超纯水为原料，通过磁力 搅拌、加热(100°C )、回流、冷却操作技术，制备粒径为10nm 40nm、浓度为10—"M 10—8M 反应液A，所述的反应液A为纳米金溶胶，所述的氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1 : l 1 : 5，较佳的反应温度为80°C IO(TC，反应时间为25 60min。 2)将特定序列寡聚核苷酸溶于缓冲溶液中，得反应液B。所述的特定序列寡聚核 苷酸为单链寡聚核苷酸(上海生工)，其中的碱基均为T碱基或是含不同个数T碱基的寡聚核苷酸，碱基个数为1 200，其浓度为10—6M 10—4M ;所述的缓冲溶液为常规的Tris、 PBS 缓冲溶液，其浓度为5 20mM ;所述的缓冲溶液中含有氯化钠，其浓度为0. 05 0. 5M。
3)在反应液B中加入三聚氰胺或经过预先处理的被测样品，充分混匀，静置。所述 的反应液B为步骤2)中的特定序列寡聚核苷酸的缓冲溶液；所述的预先处理的被测样品为 经过标准方法预处理的样品；所述的三聚氰胺浓度为10—9M 10—6M ;静置时间为1 10min。
4)以反应液A作为探针，通过比色法，即可检测三聚氰胺。所述的反应液A为步骤 1)中的纳米金溶胶，所述的反应液A与特定序列寡聚核苷酸(上海生工)的较佳摩尔比为
i : ioo i : iooo;所述的比色法为目视比色法或可见分光光度法，可见分光光度法检测
波长为400 750nm。 本检测方法用于原料奶、液态奶制品、奶粉、饲料等样品中三聚氰胺的检测，可在 IO分钟内完成。 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果 与液相色谱法(HPLC)、液相色谱_质谱法(HPLC-MS)、气相色谱_质谱法(GC-MS) 等技术相比，无需大型仪器设备，检测人员无需专门培训，仅凭裸眼即可判断结果；可用于 现场检测；直接采用商品化的寡聚核苷酸，即可实现对三聚氰胺的比色检测，其检测灵敏度 可达到了国家标准，具有简便快速、灵敏度高、选择性好、成本低，无需大型仪器，可对原料 及产品进行三聚氰胺的现场检测。 此法检测快速(10分钟内)，操作简易，灵敏度高，选择性好，通用性强。
图1以非标记的纳米金为探针，结合寡聚核苷酸检测三聚氰胺原理示意图
图2碱基T与三聚氰胺形成氢键示意图
图3A合成的纳米金溶胶电镜图 图3B以反应液A为探针，加入三聚氰胺后刚刚开始团聚的纳米金电镜图
图3C以反应液A为探针，加入稍过量三聚氰胺后团聚的纳米金电镜图
图4A寡聚核苷酸_非标记的纳米金检测三聚氰胺的紫外光谱及线性关系图
图4B寡聚核苷酸_非标记的纳米金检测三聚氰胺目视比色法示意图
具体实施方式
实施例1 : 以原料奶中三聚氰胺的检测为例具体说明检测方法，其步骤如下 1)合成纳米金所用的仪器均需用新配制的王水(1 : 3， V浓硝酸/V浓盐酸)浸泡24h
后，超纯水洗净备用。 2)将lOOmL超纯水加热煮沸，加入1.88mL氯金酸(2%， w/w)，沸腾后在加热 (IO(TC )及搅拌条件下加入10. OmL柠檬酸三钠(柠檬酸三钠质量为0. 1141g) 。 10. 0分钟 后停止加热，继续搅拌15. 0分钟，自然冷却至室温(20-25°C )。所述的氯金酸与柠檬酸三 钠的摩尔比为l : 3.88。制备得纳米金溶胶粒径为13nm、浓度为4.86X10—9M。
3)将特定序列寡聚核苷酸溶于缓冲溶液中，得反应液B。所述的特定序列寡聚核 苷酸为单链寡聚核苷酸，其中的碱基均为T碱基或是含T碱基较多的寡聚核苷酸，其浓度为
410—5M ;所述的缓冲溶液为PBS缓冲溶液，其浓度为10mM ;所述的缓冲溶液中含氯化钠，其浓 度为0. 3M。 4)在反应液B中加入经过预先处理的原料奶样品，充分混匀，静置。所述的反应 液B为步骤3)中的特定序列寡聚核苷酸缓冲溶液；所述的预先处理的原料奶样品须先经 过三氯乙酸或乙腈沉淀蛋白质，然后经过自制固相萃取整体柱预处理的样品；静置时间为 5min。 5)以反应液A作为探针，通过比色法，即可检测原料奶中三聚氰胺。所述的反应 液A为步骤2)中的纳米金溶胶，所述的反应液A与特定序列寡聚核苷酸的较佳摩尔比为 1 : IOO;所述的比色法为目视比色法或可见分光光度法，可见分光光度法检测波长范围 400 700nm。
结果 以520nm处的吸光度值表征三聚氰胺的浓度变化，其线性范围是4. 17X10—8 4. 17X10—7] ，检测限为41. 7nM。
权利要求
一种基于寡聚核苷酸-非标记的纳米金检测三聚氰胺的方法，其步骤是1)纳米金的合成以氯金酸、柠檬酸三钠、超纯水为原料，通过磁力搅拌、加热100℃、回流、冷却操作，制备粒径为10nm～40nm、浓度为10-11M～10-8M反应液A，所述的反应液A为纳米金溶胶，所述的氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1∶1～1∶5，反应温度为80℃～100℃，反应时间为25～60min；2)将特定序列寡聚核苷酸溶于缓冲溶液中，得反应液B，所述的特定序列寡聚核苷酸为单链寡聚核苷酸，其中的碱基均为T碱基或是含不同个数T碱基的寡聚核苷酸，碱基个数为1～200，其浓度为10-6M～10-4M；所述的缓冲溶液为Tris或PBS缓冲溶液，其浓度为5～20mM；所述的缓冲溶液中含有氯化钠，其浓度为0.05～0.5M；3)在反应液B中加入三聚氰胺标准溶液或经过预先处理的被测样品，混匀，静置，所述的反应液B为步骤2)中的特定序列寡聚核苷酸的缓冲溶液；所述的预先处理的被测样品为经过标准方法预处理的样品；所述的三聚氰胺浓度为10-9M～10-6M；静置时间为1～10min；4)以反应液A作为探针，通过目视比色法或紫外-可见分光光度法，检测三聚氰胺，所述的反应液A为步骤1)中的纳米金溶胶，所述的反应液A与特定序列寡聚核苷酸的摩尔比为1∶100～1∶1000；紫外-可见分光光度法检测波长为400～750nm。
全文摘要
本发明公开了一种基于寡聚核苷酸-非标记的纳米金检测三聚氰胺的方法。依次包括以下步骤1)制备一定粒径的纳米金溶胶，即反应液A；2)将特定序列寡聚核苷酸溶于缓冲溶液中，得反应液B；3)在反应液B中加入待测溶液进行反应；4)在步骤3)的反应液中加入反应液A，通过比色法，检测三聚氰胺。本发明的检测方法简便快速(检测过程不超过10min)、灵敏度高、选择性好、成本低、无需大型仪器设备即可达到国家关于乳及乳制品中三聚氰胺临时管理限量值规定的检测要求，可实现对原料及产品的现场快速检测。
文档编号G01N21/31GK101701260SQ20091027245
公开日2010年5月5日 申请日期2009年10月20日 优先权日2009年10月20日
发明者何治柯, 李丽, 黄晖 申请人:武汉大学