一种具有聚集诱导发光效应的阳离子基因载体的制备方法及其应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于非病毒基因载体
技术领域：
，具体涉及ATRP法构建以四苯基乙烯（TPE)为核心，具有聚集诱导发光(AIE)效应和高效基因转染效率等特点，并可用于细胞成像的阳离子基因载体的制备方法。【
背景技术：
】[0002]基因治疗在过去的二十年内被人们认定为一种全新有效的治疗手段，这种方法对于未来医疗有着举足轻重的作用，被广泛的用于治疗一系列遗传性疾病、人类癌症和心血管疾病等等。整个基因治疗从广义上将就是通过基因载体将用于治疗的外源设计基因或者寡聚核苷酸片段引入病体中的病变细胞，从而表达以改善病变细胞的缺陷，从而达到治疗的目的。基因治疗的整个流程有三个重要环节，其中包括目的基因的设计、基因载体的研发以及目的基因是否能在细胞中特异性表达。其中，基因载体的研发是重中之重，正是因为缺乏安全高效的基因载体才导致了基因治疗实施的瓶颈。[0003]基因载体作为将外源基因导入到细胞的工具，其本身应该低毒性并且不会引起免疫反应;其次，其要能跟基因形成具有稳定结构的复合物，同时也不会导致基因结构的变化;最后，这种载体最好能够具有一定的靶向和降解作用，这样可以针对特定的细胞进行治疗并且可以降低其滞留导致的副作用。目前人们广泛使用的基因载体包括两类:病毒载体(viralvector)和非病毒载体(non-viralvector)。病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒。这种病毒载体一般能够轻易的客服细胞屏障和免疫防御机制，从而其具有很高的转染效率。但是这种载体缺乏安全性，很容易导致致癌作用与自身免疫反应(unexpectedimmuneresponse)和白细胞的病毒变化，严重时会造成器官衰竭从而导致死亡。同时病毒载体还会引起插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体携带基因的能力有限，不利于大规模工业生产。针对以上病毒载体的缺点，人们将更多的目光投向了非病毒载体。其本身安全性能高，很多具有生物相容性或者具有生物可降解能力的基因载体都是低毒性的，而且具有很低的免疫毒性。相对于病毒载体而言，虽然这种非病毒性载体的转染效率并不是很高，有的时候很难克服细胞内外的各种屏障，但是其能够携带更多的基因，同时还能大规模工业化生产，具有很高的商业潜力。所以其发展潜力推动了非病毒载体的研究与开发。目前而言阳离子聚合物是人们使用频率最高的非病毒载体。这种阳离子非病毒性载体可以有效的通过电荷的相互作用络合上基因，从而形成带正电荷纳米级的复合体(comp1ex)，从而能够保护基因穿过细胞膜以防止被核酸酶所降解，从而保证基因的顺利表达。[0004]传统的荧光物质在聚集的情况下会导致荧光淬灭现象，这就是我们通常所说的聚集态焚光淬灭(aggregationcaused-quenching，ACQ)现象。这种现象大大限制了传统焚光物质在荧光标记及荧光探针领域的应用。如何突破传统荧光物质的限制成为了一个问题。2001年，唐本忠院士及其同事在偶然的情况下发现了聚集诱导发光现象（aggregationinducedemiSSion，AIE)，从根本上解决了传统荧光物质在聚集或浓度升高后荧光淬灭的问题。聚集诱导发光现象是指，某种荧光物质处于分散态或者浓度较低时无荧光效应，但在聚集或者浓度升高的状态下会产生荧光效应的自然现象。自AIE现象被发现以来，具有AIE现象的各种物质被广泛应用于生物检测，荧光探针等领域。[0005]近年来，活性/可控自由基聚合（living/controlledradicalpolymerization，LRP)逐渐开始成为聚合物合成的重点手段，其通过在聚合体系中引入特殊的化合物，使其与活性种链自由基进行可逆的链终止或者链转移，从而建立活性种与休眠种的动态平衡，以实现在较低温度和简易操作下聚合产品分子量和分子量分布的可控，具有很高的实用价值。LRP主要包括以下几种方式：引发转移终止剂活性自由基聚合（Initiator-Transferagent-TerminatorLivingRadicalPolymerization)、稳定自由基聚合（StableFreeRadicalPolymerization，SFRP)、原子转移自由基聚合（AtomTransferRadicalPolymerization，ATRP)、可逆加成-裂解链转移聚合（ReversibleAddition-FragmentationChainTransferPolymerization，RAFT)。其中，ATRP是通过交替的"活化-去活"的可逆反应，在降低体系中游离基浓度的情况下尽量的控制不可逆终止反应程度，而这个过程中链增长的反应则不受到影响，从而实现"活性"聚合。ATRP的引发剂一般为常见的卤化烷烃，其反应温度适中，适用于大部分单体，而且整个过程不需要复杂的合成路线，相对于其他的活性聚合具有更多的优势。[0006]细胞成像技术是细胞和分子水平上进行生物学行为研究的一项技术，是近年来发展最快的生命科学和药物学的研究方法，是最直接观察细胞和分子在体内行为的一项新兴技术。细胞成像是当今可见光成像的最新技术潮流，不仅由荧光、生物发光和同位素三种成像方法构成完整的功能成像体系，还有X光成像提供结构成像，二者相叠加，实现特异性信号的精确定位，真正体现细胞成像技术的两大技术优势一空间上的分布和时间上的变化。对于生命科学和药物学等研究而言，了解横向空间上的分布和纵向时间上的变化尤其重要。要了解所研究对象的特性，就必须掌握其进入细胞后具体的分布情况，同时，还必须掌握所研究的对象在时间上的变化。细胞成像技术圆满的解决了上述问题。[0007]随着高分子科学的不断进步，如何将其与现代医学、生物学以及工程学等学科更好的相互交融与渗透成为人们现在重点解决的难题。而在基因治疗方面，高分子材料已经体现出了很高的利用价值。目前，文献报道过一系列的非病毒阳离子基因载体，包括聚-L-赖氨酸（Poly(L-Lysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物（Poly(amidamine)，PAMAM)、聚甲基丙稀酸N，N_二甲氛基乙酯（Poly(2-dimethylaminoethy1methacrylate)，Ρ?ΜΑΕΜΑ)、聚乙稀亚胺(P〇lyethylenimine，PEI)等。其中PEI是阳离子非病毒载体中公认的"金标"。但是PEI该类阳离子基因载体并不能将材料进入细胞的过程完整的展现出来，只能通过转染等表征手段间接展示。所以，将基因载体与细胞成像技术结合成为了现如今研究的热点。[0008]近几年研究者致力于ATRP理论和应用的研究工作，已经能够熟练的利用这种活性聚合手段得到一系列能够用于现代生物医学方面的聚合物材料，例如改性过的PEGDMAEMA、PEGMA等等，都是最新的阳离子基因载体研究成果，同时促进了活性可控聚合在医用生物高分子中的应用。[0009]乙醇胺是一种在室温下无色透明的粘稠液体，有一定的吸湿性和氨臭，被广泛用作化学试剂、农药、医药、溶剂、染料中间体、橡胶促进剂和表面活性剂等等。[0010]利用活性可控聚合ATRP得到一系列类脂质体阳离子基因载体在研究的过程中还存在很多的问题，例如:这种阳离子载体随着分子量的增大，响应的转染效率更高，但是毒性更大，如何在保证毒性适中的情况下尽量提高转染效率以及保证成像效果成为人们关注的重点；不同的单体具有不同的特性，有些转染效率较高，有效毒性较小，如何筛选出高效高性能的单体也是人们需要考虑的问题。【
发明内容】[0011]本发明的目的是提供一种活性可控自由基聚合法(ATRP)构建以四苯基乙烯为核心的阳离子基因载体，该阳离子基因载体分子量可控，分布窄，不仅可形成胶束增加细胞的转染效率，并且还具有AIE效应，可用于细胞成像。具有很高的商业潜能，同时具备投入临床试验的可能。[0012]本发明的技术方案:可修饰的四苯基乙烯衍生物分子，与二溴异丁酰溴(BIBB)进行反应生成带有四个引发位点的星形引发剂;最后通过原子转移自由基活性聚合(ATRP)弓丨发各种单体进行聚合;得到聚合物后再用乙醇胺(EA)和带有氨基的四苯基乙烯分子进行开环反应，得到阳离子基因载体。[0013]-种具有聚集诱导发光效应的阳离子基因载体的制备方法，其具体操作步骤为：[0014]1)聚合反应:聚合反应体系在无氧环境下连续进行，聚合反应完成后加入水或者甲醇，或者暴露在空气中，使引发体系失活并且终止聚合，加入的水或者甲醇是四苯基乙烯星形引发剂的质量的200-400倍，然后用乙醚、乙醇或者甲醇沉淀直到形貌变为固体，将其放入真空干燥箱中除去乙醚、乙醇或者甲醇得到粉末状或者絮状的固体;所述的聚合反应体系包括四苯基乙烯星形引发剂、有机溶剂、单体、配体、CuBr;其中单体与四苯基乙烯星形引发剂的质量比为〇.001-50，优选0.01-40，更优选0.05-30;配体与四苯基乙烯星形引发剂的质量比为0.01-1.4,优当前第1页1 2 3