专利名称：一种增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂， 具体涉及一种P-葡聚糖寡糖-微生物疫苗免疫制剂。 技术领域微生物疫苗包括微生物灭活疫苗和蛋白亚单位疫苗，在防治多种微生 物感染疾病中起着非常重要的作用。为了提高疫苗的免疫效果或改变疫苗 免疫应答的类型，往往在疫苗中加入佐剂。疫苗的免疫效果往往需要一种与之相匹配的佐剂才能更好地发挥疫苗抗感染的特性。目前国外已经试验的佐剂有ioo多种。常用的佐剂包括铝胶、矿物油、灭活细菌和化学合成物质等，免疫佐剂的研究逐渐成为疫苗 研究的重要内容之一。经典的氢氧化铝佐剂是目前批准人用疫苗最常用的 佐剂，但很难满足现代各种新型疫苗的需要和发展。氢氧化铝佐剂具有高 效吸附水溶性抗原，缓慢释放不断刺激机体产生体液免疫,主要用于白喉、 破伤风、麻疹等疫苗。然而，氢氧化铝佐剂在注射部位缓慢释放抗原的效 应较低，对很多抗原效果不确实。此外，在研的佐剂还有矿物油、天然的微生物产物或合成的微生物产物衍生物、皂苷类(Quil A, ISC0Ms)。不同来源的多糖或者寡糖具有很强的免疫调节作用，可通过与宿主细 胞特别是巨噬细胞和树突状细胞表面的受体相互作用并激活细胞的活性 产生免疫调节活性。香菇和灵芝作为食物和药物在中国被广泛的应用，最近的研究发现从香菇和灵芝中提取的香菇多糖和灵芝多糖具有抗感染，抗 肿瘤和免疫调节等广泛的作用，这些作用的发挥是通过激活天然免疫应答 中的巨噬细胞和树突状细胞等以及增强细胞介导的免疫应答，但是天然多 糖的提取存在产量低、纯度不高等缺陷，在应用上存在一定的限制。目前可以通过人工合成的方法获得具有药用作用的寡糖("可作药物的 寡糖及其硫酸化产物和它们的制备方法及含该寡糖的药物组合物"01136237.5宁君;孔繁拃;顾建新)。人工合成的香菇多糖和灵芝多糖的基 本结构单位e-葡聚糖寡糖，以P-(1 —3)连接为主链，—6)连接为 侧链的寡糖及其类似物，该产品无毒性、无刺激性并具有良好的水溶性， 具有抗肿瘤、抗病毒如抗人类免疫缺损病毒(HIV)的作用，以及提高机 体天然免疫力的作用。人工合成寡糖具有合成容易，纯度高以及产量高的 优势。 发明内容本发明的目的是提供一种有效增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂。 具体涉及一种p-葡聚糖寡糖-微生物疫苗免疫制剂。本发明采用P-葡聚糖寡糖和微生物疫苗制成免疫制剂，其中，P-葡 聚糖寡糖微生物疫苗为25-100: 1。所述的P-葡聚糖寡糖为药用级人工合成P-葡聚糖寡糖 (01136237.5 )，是以P-(1 —3)连接为主链，P - (1 — 6)连接为侧链的寡糖及其类似物。所述的微生物疫苗是灭活微生物疫苗、蛋白疫苗或亚单位疫苗，尤其 是经非消化道注射的疫苗。的p-葡聚糖寡糖作为免疫佐剂，与灭活疫苗或蛋 白疫苗或亚单位疫苗联合制成免疫制剂，能明显增强疫苗的稳定性和免疫 原性。本发明的目的通过下述技术方案实现釆用人工合成的寡糖[P-(卜3)连接为主链，P-(1 —6)连接为侧链] 与微生物疫苗按25-100: l比例配制，制备成人工合成的P-葡聚糖寡糖-疫苗免疫制剂。本发明人工合成P -葡聚糖寡糖-疫苗免疫制剂其中所述的P-葡聚糖 寡糖的浓度可根据不同疫苗进行调节。本发明所述的人工合成的P-葡聚糖寡糖的优点是其合成相对容易，产 量高而且纯度高，而且人工合成的寡糖的可修饰性，可以根据需要对合成 的寡糖进行修饰。同时人工合成P-葡聚糖寡糖将灭活疫苗蛋白连接，具 有独特的增强疫苗免疫原性的佐剂作用，可诱导全身免疫应答，特别是诱 导有效的TH2类免疫应答，产生高滴度的中和抗体。
图l是免疫小鼠血清抗乙型肝炎病毒表面抗原的抗体效价图。 图2是免疫小鼠脾脏淋巴细胞特异性刺激后Thl和Th2类细胞因子 的分泌图，其中PBS-磷酸缓冲液，G-p-葡聚糖，H-HBsAg， F-福氏佐剂。
具体实施方式
实施例1制备人工合成P-葡聚糖寡糖-HBsAg蛋白疫苗免疫制剂 采用药用级人工合成葡聚糖寡糖溶于磷酸缓冲液，0. 01M PBS， PH7.2,配制成10mg/ml。按25: 1 (W/W)加入乙肝疫苗(HbsAg，为亚单 位疫苗，北京生物制品研究所)，混勻，置4。C孵育24小时，即得人工合 成P-葡聚糖寡糖-HBsAg蛋白疫苗免疫制剂。 实施例2制备人工合成P -葡聚糖寡糖-HBsAg蛋白疫苗免疫制剂 釆用药用级人工合成p-葡聚糖寡糖溶于磷酸缓冲液，0. 01M PBS， PH7.2,配制成10mg/ml。按50: 1 (W/W)加入乙肝疫苗，混匀，置4°C 孵育24小时。即得人工合成P-葡聚糖寡糖-HBsAg蛋白疫苗免疫制剂。 实施例3制备人工合成P-葡聚糖寡糖-HBsAg蛋白疫苗免疫制剂 采用药用级人工合成P-葡聚糖寡糖溶于磷酸缓冲液，0.01M PBS, PH7. 2，配制成10mg/ml。按100: 1 (W/W)加入乙肝疫苗，混匀，置4。C 孵育24小时。即得人工合成P-葡聚糖寡糖-HBsAg蛋白疫苗免疫制剂。 实施例4制备人工合成P -葡聚糖寡糖-灭活SARS冠状病毒疫苗免疫制剂 采用人工合成P-葡聚糖寡糖溶于磷酸缓冲液，0. 01MPBS, PH7.2,配 制成10mg/ml。按25: 1 (W/W)与灭活的SARS冠状病毒液(CGMCC No. O977, ZL200410017527. 1 )配置，置4。C孵育24小时，获得人工合成P-葡聚糖 寡糖-灭活SARS冠状病毒免疫制剂。 实施例5p-葡聚糖寡糖增强乙肝疫苗诱导的体液免疫应答试验免疫接种的小鼠为4~6周的Balb/c小鼠，通过注射的方法接种200 Ul人工合成e-葡聚糖寡糖-HBsAg蛋白疫苗免疫制剂(25-100 Mg: lpg HBsAg/只)，于第30天加强免疫一次，方法剂量同前。自第4周开始每隔 一周经眼静脉釆血，分离血清，用ELISA检测血清中抗-HBs的抗体滴度 和抗体亚类。结果显示与HBsAg单独免疫组相比，人工合成P-葡聚糖寡 糖-HBsAg免疫小鼠后能够增强HBsAg蛋白疫苗诱导的抗-HBs IgG抗体滴 度，而且抗体亚类以IgGl类为主，抗-HBs IgGl的滴度以及IgGl和IgG2a 的比例也明显比单独免疫组要高。提示所述寡糖具有佐剂样的作用能增强 HBsAg蛋白疫苗诱导的体液免疫应答。表1是免疫小鼠血清中抗-HBs抗体的亚类。表1.免疫组抗-HBsAg抗体的滴度 IgGl IgG2a抗体的亚类 IgGl/IgG2a ratio磷酸缓冲液<100<100—p-葡聚糖<100<100一乙肝疫苗(HbsAg)2， 70016016. 9HBsAg +P-葡聚糖4,590*15030. 6*HBsAg+福氏佐剂4，150*870*4. 8实施例6增强HBsAg蛋白疫苗诱导的特异性细胞免疫应答试验 免疫小鼠在加强免疫后的第2周，处死小鼠，分离小鼠的脾淋巴细胞，体外用HBsAg刺激，利用ELISPOT方法检测HBsAg特异性脾淋巴细胞分泌 Thl类(IFN-y )和TH2类(IL-4)细胞因子的能力。结果显示体外受 HBsAg刺激后，P-葡聚糖寡糖-HBsAg免疫小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子 IL-4的能力明显要高于HBsAg单独免疫组，而两组免疫小鼠脾淋巴细胞分 泌IFN-y的能力相同，提示p-葡聚糖寡糖能够增强HBsAg蛋白疫苗诱导 的TH2类的免疫应答，但是对TH1类免疫应答并没有明显影响。 实施例7P-葡聚糖寡糖增强SARS冠状病毒疫苗的免疫原性试验 P-葡聚糖寡糖-SARS冠状病毒(G250 )灭活疫苗免疫制剂(lOOjage-葡聚糖寡糖4jag SARS冠状病毒/只)，注射免疫Balb/c小鼠，4周后加 强免疫l次，共免疫2次。第2次将强免疫后2周将小鼠处死，取血分离 血清，保存于-70°C，待检。检测抗-SARS冠状病毒的中和抗体；结果显示 P-葡聚糖寡糖-灭活疫苗制剂的免疫效果明显高于灭活疫苗，其诱导产生 血清中和抗体效价(1: 10000 )高于单独灭活疫苗(1: 2000 )。
权利要求
1. 一种增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂，其特征是由β-葡聚糖寡糖和微生物疫苗组成，其中，β-葡聚糖寡糖微生物疫苗为25-100∶1。
2、 根据权利要求1所述的增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂，其特征是所述的葡聚糖寡糖是药用级人工合成P-葡聚糖寡糖，其结构是以P —3)连接为主链，—6)连接为侧链的寡糖及其类似物。
3、 根据权利要求1所述的增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂，其特征 是所述的微生物疫苗是灭活微生物疫苗、蛋白疫苗或亚单位疫苗。
4、 根据权利要求1或3所述的增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂，其 特征是所述的微生物疫苗是经非消化道注射的疫苗。
5、 根据权利要求1所述的增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂，其特征 是所述的p-葡聚糖寡糖作为免疫佐剂。
6、 根据权利要求1或5所述的增强微生物疫苗免疫原性的免疫制剂，其 特征是所述的P-葡聚糖寡糖的浓度根据不同疫苗进行调节。
全文摘要
本发明属生物技术领域，涉及一种可作药物作用的β-葡聚糖寡糖-微生物疫苗免疫制剂，本发明以人工合成β-葡聚糖寡糖作为佐剂，与微生物疫苗制成免疫制剂，能增强微生物灭活疫苗、蛋白疫苗或亚单位疫苗稳定性和免疫原性。实验结果显示，本发明免疫制剂可增强疫苗诱导的体液免疫应答和细胞介导的TH2类免疫应答以及增强病毒蛋白诱导的体液免疫应答，免疫效果明显高于蛋白疫苗或灭活疫苗。
文档编号A61K39/00GK101244267SQ20071003745
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月12日 优先权日2007年2月12日
发明者涤 瞿, 董生福, 顾建新 申请人:复旦大学