检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒及寡核苷酸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测甘薯杆状DNA病毒A的实时荧光定量PCR(qPCR)检测试剂盒 及寡核苷酸，属于检验检疫领域。
【背景技术】
[0002] 甘墓杆状0嫩病毒4(3*66〖口〇丨&1:〇&&(1仙￥；[1'118 4)是花挪菜花叶病毒科杆状0嫩 病毒属成员，是甘薯上新发现的一种病毒。目前已经在美国、坦桑尼亚和中国报道。关于该 病毒引起的症状及其危害还不清楚。
[0003] 目前，国内外已报道检测植物病毒的方法有指示植物法、分子杂交、ELISA、RT-PCR 和基因芯片技术等，这些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，有的易于造成交 叉污染，出现假阳性结果。qPCR技术是在常规PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技 术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性荧光探针（TaqMan探针），探针与 模板特异性结合，其结合位点位于引物对之间，利用荧光信号累积实时监测整个PCR过程。 该技术可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测，其中绝对定量是目前采用最 多的一种，但是需要采用外标准品的定量制备来实现。在qPCR定量检测中，这些外标准品 的制备成为其能否准确定量的关键。qPCR整个过程在全封闭的状态下进行扩增及产物分 析，有效地减少污染及对人体的危害。该技术具有特异性强、灵敏度高、自动化程度高、检测 简单快速、技术易于掌握等特点，是快速分子诊断的发展趋势。
[0004] 目前qPCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检测、线 虫检测等诸多领域，但对甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测尚未见公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的检测甘薯杆状 DNA病毒A的寡核苷酸，包括引物和探针。
[0006] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测甘薯杆状DNA 病毒A的qPCR检测试剂盒。
[0007] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检 测方法。
[0008] 为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一组检测甘薯杆状DNA病毒A的寡核苷酸，为序列表SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 3 所示的寡核苷酸，其中序列SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2分别为检测甘薯杆状DNA病毒A的 正义引物和反义引物，序列SEQIDNo. 3为检测甘薯杆状DNA病毒A的荧光探针，具体为：
[0010] 引物SPBV-A-FP:5, -AGGATGGCAGAAGCACGGT-3,，（SEQIDNo. 1);
[0011] 引物SPBV-A-RP:5' -TGGTTTTCTGTCCCTTCAGTGG-3'，（SEQIDNo. 2);
[0012] 探针SPBV-A-P:5' -TAGCCCGTGITCTAGGAAGGCCATACAGA-3'，（SEQIDNo. 3);探针的 5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针扩增的目标片 段长度为182bp。
[0013] 为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0014] 本发明提供了一种检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒，其包括用于检测 甘薯杆状DNA病毒A的引物和探针。具体地，引物和探针如序列表SEQIDNo. 1至SEQID No. 3所示，其中序列SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2分别为检测甘薯杆状DNA病毒A的正义 引物和反义引物，序列SEQIDNo. 3为检测甘薯杆状DNA病毒A的荧光探针，该探针的5' 端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针可以分装，也可以 预先混合在一起。
[0015] 所述检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。其 中，所述阴性对照：采用无甘薯杆状DNA病毒A感染甘薯叶片，液氮研磨后，加入ddH20充分 研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于ddH20 ;所述阳性对照：采用感染 甘薯杆状DNA病毒A感染甘薯叶片，液氮研磨后，加入ddH20充分研磨，然后5000rpm离心 3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水。
[0016] 进一步地，上述检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒还包括完成qPCR反应 所需的试剂和酶，例如使用商业化购买的试剂2XPremix Ex Taq?和ddH20,均购自TaKaRa 公司。
[0017] 为解决第三个技术问题，本发明还提供了检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测方 法，包括如下步骤：
[0018] (1)提取样品DNA;
[0019] 取携带甘薯杆状DNA病毒A的甘薯叶片，经DNA提取试剂盒（购自Qiagen公司） 提取植物总DNA，也可以使用现有技术中已知的提取DNA的方法进行提取；
[0020] (2)对提取的样品DNA进行qPCR扩增：
[0021] 表1qPCR反应体系
[0022]
[0023] 反应条件：
[0024] 50°C15min;95°C5min;然后 95°C5s，60°C30s，共 40 个循环。
[0025] (3)结果判定：
[0026] 结果分析条件设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最 高点。CT值< 35,而且出现明显的扩增曲线为阳性，表明样品中存在SPBV-A;无CT值，并 且无扩增曲线为阴性，表明样品中无SPBV-A。
[0027] 本发明针对当前无甘薯杆状DNA病毒A检测有效方法，提供了一种操作简单、快 速、灵敏、准确的检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测方法，可达到准确定量待测样品中 SPBV-A的目的。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 1、本发明所提供的引物和探针可用于甘薯杆状DNA病毒A的定性及定量分析，对 判断SPBV-A在植物体内复制规律、复制水平和用药后SPBV-A是否被清除等方面的研究具 有重要意义；
[0030] 2、本发明将在甘薯杆状DNA病毒A的大规模检疫、流行病学调查及早期诊断方面 发挥重要作用。
【附图说明】
[0031] 图1为甘薯杆状DNA病毒A引物和探针特异性扩增曲线。
[0032] 图2为6份待测样品的qPCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不 用于限制本发明的保护范围。
[0034] 以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
[0035] 以下实施例中所用材料、试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。
[0036] 实施例1检测甘薯杆状DNA病毒A的专用引物和探针的设