计
[0037] 从GenBank获得甘薯杆状DNA病毒A的基因序列，利用DNAMAN6. 0. 40软件进行比 对分析，找出SPBV-A的保守基因序列，用软件PrimerExpress3. 0设计引物和TaqMan探 针，再将设计的引物和探针在NCBI上比对，通过筛选、检验最终确定一对引物和一条探针， 其序列为：引物SPBV-A-FP:5'-AGGATGGCAGAAGCACGGT-3'（SEQIDNo. 1);引物SPBV-A-RP: 5，-TGGTTTTCTGTCCCTTCAGTGG-3，（SEQIDNo.2);探针SPBV-A-P:5，-TAGCCCGTGTTCTAGGAA GGCCATACAGA-3'（SEQIDNo. 3)。探针5'端含有FAM报告荧光染料，3'端含有淬灭荧光染 料BHQ1。所有引物和探针由大连宝生物技术公司合成。
[0038] 实施例2检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒的组成
[0039] 检测试剂盒包括用于检测甘薯杆状DNA病毒A的引物和探针、阴性对照和阳性对 照。具体地，引物和探针如序列表SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 3所示，其中序列SEQIDNo. 1 和SEQIDNo. 2分别为检测甘薯杆状DNA病毒A的正义引物和反义引物，序列SEQIDNo. 3 为检测甘薯杆状DNA病毒A的荧光探针，该探针的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记 淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针分装。
[0040] 所述阴性对照：采用无甘薯杆状DNA病毒A感染甘薯叶片，液氮研磨后，加入ddH20 充分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于ddH20 ;所述阳性对照：采用感 染甘薯杆状DNA病毒A感染甘薯叶片，液氮研磨后，加入ddH20充分研磨，然后5000rpm离 心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水。
[0041] 所述检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒还包括完成qPCR反应所需的试 剂和酶，例如使用商业化购买的试剂2XPremix Ex Taq?和ddH20,均购自TaKaRa公司。
[0042] 实施例3qPCR检测甘薯杆状DNA病毒A的特异性试验
[0043] 具体过程包括以下步骤：
[0044] 一、样品来源
[0045]甘署杆状DNA病毒A(GrapevineEvirus，SPBV-A)，甘署杆状DNA病毒 B(GrapevineEvirus，SPBV-B)和番前黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurl virus，TYLCV)由北京出入境检验检疫局植物检疫实验室保存。
[0046] 二、植物总DNA的提取
[0047] 对步骤一中的样品经DNA提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取植物总DNA，具体 操作见试剂盒说明书；
[0048] 三、特异性检测试验
[0049] 以步骤一和步骤二获得的植物总DNA为模板，S卩：SPBV-A、SPBV-B和TYLCV总 DNA，水为空白对照，进行qPCR反应。在20yL反应体系中加入10yL2XPremixEx Taq?，0? 4yL引物SPBV-A-FP(10yM)，0? 4yL引物SPBV-A-RP(10yM)，0? 2yL探针 SPBV-A-P(10yM)，2yLDNA(10pg/yL~100ng/yL)，ddH20 补至 20yL。反应条件为： 50°C15min;95°C5min;然后94°C15s，60°C30s，共40个循环。结果如图1所示，所设计的 引物和探针有较强的特异性，只能检测出SPBV-A，不能检出SPBV-B和TYLCV。
[0050] 实施例4田间样品检测
[0051] 从不同地区采集的甘薯样品抽取6株，按本发明所述检测方法提取总DNA，然后进 行qPCR反应。扩增曲线见图2,定量数据见表3。
[0052] 表3待测样品的qPCR
[0053]
[0054] 显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1. 一组检测甘薯杆状DNA病毒A的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ ID No. 1至序列表SEQ ID No. 3所示；其中序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2分别为检测 甘薯杆状DNA病毒A的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No. 3为检测甘薯杆状DNA病毒 A的荧光探针。2. 根据权利要求1所述的检测甘薯杆状DNA病毒A的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光 探针序列SEQ ID No. 3的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQl。3. 权利要求1或2所述的检测甘薯杆状DNA病毒A的寡核苷酸在制备检测甘薯杆状 DNA病毒A试剂盒中的应用。4. 一种甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求 1或2所述的检测大丽花潜隐类病毒的寡核苷酸。5. 根据权利要求4所述的qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阴性对照和 阳性对照。6. 根据权利要求4或5所述的qPCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括 2XPremix Ex Taq?和 ddH20。7. -种甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 提取样品DNA ; (2) 对提取的样品DNA进行qPCR扩增；其中，使用序列表SEQ ID No. 1所示的正义引 物，序列表SEQ ID No. 2所示的反义引物，序列表SEQ ID No. 3所示的荧光探针，所述荧光 探针的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQl ; (3) 根据qPCR反应体系的荧光强度进行结果判定。
【专利摘要】本发明公开了一种检测甘薯杆状DNA病毒A的qPCR检测试剂盒及寡核苷酸。具体地，本发明提供了一组检测甘薯杆状DNA病毒A的寡核苷酸，为序列表SEQ？ID？No.1至序列表SEQ？ID？No.3所示，其中序列SEQ？ID？No.1和SEQ？ID？No.2分别为检测甘薯杆状DNA病毒A的正义引物和反义引物，序列SEQ？ID？No.3为检测甘薯杆状DNA病毒A的荧光探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的检测试剂盒及其检测方法，可达到准确检测待测样品中SPBV-A的目的。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN105063042
【申请号】CN201510586895
【发明人】李永强, 赵晓丽, 邓丛良, 吕玉峰, 刘兴亮, 骆卫峰
【申请人】中华人民共和国北京出入境检验检疫局, 北京农学院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年9月15日