一种圆口铜鱼微卫星标记及其应用
一种圆口铜鱼微卫星标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及8个圆口铜鱼微卫星标记，其 扩增引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 微卫星DNA，又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以1-6个碱基的短核苷 酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成 了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根 据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分 析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富， 遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA数量极少，对DNA质量要求不 高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、 功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。
[0003] 圆 口铜鱼（Coreiusguichenoti)，隶属趣形目Cypriniformes，鉤亚科 Gobioninae，铜鱼属Coreius，是一种主要分布于长江上游、金沙江中下游及其部分支流如 雅砻江下游的特有鱼类。圆口铜鱼属于典型的河道洄游性鱼类，成熟亲鱼向上溯游到金沙 江中下游产卵，受精卵和初孵仔鱼在天然河道漂流才能完成孵化过程并具有主动游泳能 力，整个生活史均需在河道中完成。圆口铜鱼成鱼只生活在干流的急流河滩和较流动的洄 水沱中，不进入水流缓慢的小支流，而性成熟个体只在金沙江中下游以及雅砻江干流等部 分江段发现，该江段也是圆口铜鱼产卵场的分布区域。随着长江上游干支流梯级电站建设 的逐步实施，圆口铜鱼栖息地面积日益缩小，生境相互隔离。已建成的葛洲坝工程阻隔了长 江中游圆口铜鱼对金沙江繁殖群体的补充通道，同时蓄水运行的三峡工程也对顺流而下的 圆口铜鱼幼鱼产生一定的阻隔作用，再加上过度捕捞、环境污染等原因，圆口铜鱼资源严重 下降，在1997-2000年的调查中，圆口铜鱼和铜鱼在巴南与万州江段的渔获物总重中分别 47%和17%，在2005-2006年的调查中，已下降到36%和8%，因此，对圆口铜鱼的研究和保 护工作迫在眉睫。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供圆口铜鱼微卫星标记及其扩增引物，即提供8个圆口铜鱼的 微卫星标记，以及相应的扩增引物对，为圆口铜鱼的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助 育种技术提供有效的工具。
[0005] 本发明一个方面提供8个微卫星标记，其核苷酸序列分别如SEQIDN0 :1-8之一 所示，或为上述核苷酸序列的互补序列。
[0006] 本发明还提供分别用于扩增上述8个微卫星标记的引物对。优选地，所述引物对 设计参数为：引物长度17_25bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65°C， 6(：含量在40%-60%之间。优选地，上下游序列分别为3￡01〇勵：9化61]0064)、3￡0 IDN0:10(CGU006-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQIDN0:1所示的微卫星标记 (CGU006);上下游序列分别为SEQIDN0:11(CGU060-F)、SEQIDN0:12(CGU060-R)的引 物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO:2(CGU060)的微卫星标记；上下游序列分别为 SEQIDN0:13(CGU068-F)、SEQIDN0:14(CGU068-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为 SEQIDN0:3(CGU068)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDN0:15(CGU070-F)、SEQ IDN0:16(CGU070-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDN0:4(CGU070)的微卫星 标记；上下游序列分别为SEQIDN0:17(CGU075-F)、SEQIDN0:18(CGU075-R)的引物对， 用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO:5(CGU075)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQID N0:19(CGU076-F)、SEQIDN0:20(CGU076-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID N0:6(CGU076)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDN0:21(CGU079-F)、SEQIDNO: 22(CGU079-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDN0:7(CGU079)的微卫星标记；上 下游序列分别为SEQIDN0:23(CGU104-F)、SEQIDN0:24(CGU104-R)的引物对，用于扩增 核苷酸序列为SEQIDN0:8(CGU104)的微卫星标记。
[0007] 另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在检测圆 口铜鱼种群遗传多样性中的应用。
[0008] 另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在分析圆 口铜鱼亲缘关系中的应用。
[0009] 另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在圆口铜 鱼辅助育种中的应用。
[0010] 本发明还提供了检测圆口铜鱼种群遗传多样性的方法，包括如下步骤：
[0011] (1)提取圆口铜鱼基因组DNA;
[0012] (2)微卫星PCR扩增：利用经荧光标记的用于扩增本发明的微卫星标记的引物对， 以圆口铜鱼基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；
[0013] (3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，用ABI3730XL测序仪进行毛细 管电泳和STR分析；
[0014] (4)遗传多样性分析：根据每个圆口铜鱼个体微卫星扩增产物的分子量大小确定 基因型，采用GENEP0P4. 0. 10计算遗传多样性参数。
[0015] 优选地，步骤（1)采用酚-氯仿法提取圆口铜鱼鳍条组织的基因组DNA;
[0016] 优选地，步骤（2)中所述荧光标记为FAM标记。
[0017] 本发明从圆口铜鱼基因组DNA中筛选8个微卫星标记，根据微卫星重复序列两端 的侧翼区设计特异性引物并进行扩增，获得的扩增产物具有高度的多态性和稳定性，可用 于圆口铜鱼的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
【具体实施方式】
[0018] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不 背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0019] 对于实施例中未注明具体条件的实施方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实施指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运 行。
[0020] 1、含有微卫星重复单元的序列的查找
[0021] 从构建的圆口铜鱼基因文库的序列中用软件SSRHunterl. 3进行微卫星重复单元 序列的查找；参数设置为查找
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及8个圆口铜鱼微卫星标记，其 扩增引物对及其应用。
【背景技术】
[0002] 微卫星DNA，又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以1-6个碱基的短核苷 酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成 了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根 据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分 析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富， 遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA数量极少，对DNA质量要求不 高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、 功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。
[0003] 圆 口铜鱼（Coreiusguichenoti)，隶属趣形目Cypriniformes，鉤亚科 Gobioninae，铜鱼属Coreius，是一种主要分布于长江上游、金沙江中下游及其部分支流如 雅砻江下游的特有鱼类。圆口铜鱼属于典型的河道洄游性鱼类，成熟亲鱼向上溯游到金沙 江中下游产卵，受精卵和初孵仔鱼在天然河道漂流才能完成孵化过程并具有主动游泳能 力，整个生活史均需在河道中完成。圆口铜鱼成鱼只生活在干流的急流河滩和较流动的洄 水沱中，不进入水流缓慢的小支流，而性成熟个体只在金沙江中下游以及雅砻江干流等部 分江段发现，该江段也是圆口铜鱼产卵场的分布区域。随着长江上游干支流梯级电站建设 的逐步实施，圆口铜鱼栖息地面积日益缩小，生境相互隔离。已建成的葛洲坝工程阻隔了长 江中游圆口铜鱼对金沙江繁殖群体的补充通道，同时蓄水运行的三峡工程也对顺流而下的 圆口铜鱼幼鱼产生一定的阻隔作用，再加上过度捕捞、环境污染等原因，圆口铜鱼资源严重 下降，在1997-2000年的调查中，圆口铜鱼和铜鱼在巴南与万州江段的渔获物总重中分别 47%和17%，在2005-2006年的调查中，已下降到36%和8%，因此，对圆口铜鱼的研究和保 护工作迫在眉睫。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供圆口铜鱼微卫星标记及其扩增引物，即提供8个圆口铜鱼的 微卫星标记，以及相应的扩增引物对，为圆口铜鱼的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助 育种技术提供有效的工具。
[0005] 本发明一个方面提供8个微卫星标记，其核苷酸序列分别如SEQIDN0 :1-8之一 所示，或为上述核苷酸序列的互补序列。
[0006] 本发明还提供分别用于扩增上述8个微卫星标记的引物对。优选地，所述引物对 设计参数为：引物长度17_25bp，PCR产物片段长度范围100-350bp，最适退火温度55-65°C， 6(：含量在40%-60%之间。优选地，上下游序列分别为3￡01〇勵：9化61]0064)、3￡0 IDN0:10(CGU006-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列如SEQIDN0:1所示的微卫星标记 (CGU006);上下游序列分别为SEQIDN0:11(CGU060-F)、SEQIDN0:12(CGU060-R)的引 物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO:2(CGU060)的微卫星标记；上下游序列分别为 SEQIDN0:13(CGU068-F)、SEQIDN0:14(CGU068-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为 SEQIDN0:3(CGU068)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDN0:15(CGU070-F)、SEQ IDN0:16(CGU070-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDN0:4(CGU070)的微卫星 标记；上下游序列分别为SEQIDN0:17(CGU075-F)、SEQIDN0:18(CGU075-R)的引物对， 用于扩增核苷酸序列为SEQIDNO:5(CGU075)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQID N0:19(CGU076-F)、SEQIDN0:20(CGU076-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQID N0:6(CGU076)的微卫星标记；上下游序列分别为SEQIDN0:21(CGU079-F)、SEQIDNO: 22(CGU079-R)的引物对，用于扩增核苷酸序列为SEQIDN0:7(CGU079)的微卫星标记；上 下游序列分别为SEQIDN0:23(CGU104-F)、SEQIDN0:24(CGU104-R)的引物对，用于扩增 核苷酸序列为SEQIDN0:8(CGU104)的微卫星标记。
[0007] 另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在检测圆 口铜鱼种群遗传多样性中的应用。
[0008] 另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在分析圆 口铜鱼亲缘关系中的应用。
[0009] 另一方面，本发明涉及所述微卫星标记或扩增所述微卫星标记的引物对在圆口铜 鱼辅助育种中的应用。
[0010] 本发明还提供了检测圆口铜鱼种群遗传多样性的方法，包括如下步骤：
[0011] (1)提取圆口铜鱼基因组DNA;
[0012] (2)微卫星PCR扩增：利用经荧光标记的用于扩增本发明的微卫星标记的引物对， 以圆口铜鱼基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；
[0013] (3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，用ABI3730XL测序仪进行毛细 管电泳和STR分析；
[0014] (4)遗传多样性分析：根据每个圆口铜鱼个体微卫星扩增产物的分子量大小确定 基因型，采用GENEP0P4. 0. 10计算遗传多样性参数。
[0015] 优选地，步骤（1)采用酚-氯仿法提取圆口铜鱼鳍条组织的基因组DNA;
[0016] 优选地，步骤（2)中所述荧光标记为FAM标记。
[0017] 本发明从圆口铜鱼基因组DNA中筛选8个微卫星标记，根据微卫星重复序列两端 的侧翼区设计特异性引物并进行扩增，获得的扩增产物具有高度的多态性和稳定性，可用 于圆口铜鱼的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
【具体实施方式】
[0018] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不 背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0019] 对于实施例中未注明具体条件的实施方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实施指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运 行。
[0020] 1、含有微卫星重复单元的序列的查找
[0021] 从构建的圆口铜鱼基因文库的序列中用软件SSRHunterl. 3进行微卫星重复单元 序列的查找；参数设置为查找
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0访客 来自[德国] 2019年10月24日 04:299
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