一种水稻千粒重基因tgw6引导rna靶点序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点 序列及应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（OryzasativaL.)是世界上重要的粮食作物之一，养活着全球半数以上的 人口，也是我国近一半人口的主要食物来源。随着人口的不断增长，人们对粮食的需求也 越来越大。杂种优势的有效利用对水稻产量的提高起了重要的推动作用，然而，单位面积 的水稻产量一直没有太大提升，而且随着耕地面积的减少，水稻的种植面积一直在下降， 迫切需要借助新的遗传改良策略来大力提高水稻的产量。近几年，随着几个控制谷粒大 小的基因（GS3、SW5和GW8)、粒宽粒重（GW2、GW5)、粒长粒宽的基因（qGLl、qGWl、GS7和 qSS7)及千粒重基因（TGW6)等与产量相关基因相继被克隆，部分产量相关基因已经被广 泛用于水稻高产品种的培育中。这些产量性状相关基因中，以调控粒长粒重的千粒重基 因（Thousand-grainWeight6，TGW6)的遗传力最大，Ishimaru等（2013)的研究发现， Kasalath的tgw6基因能使日本晴在抽穗前的籽粒碳水化合物的积累增加，从而使日本晴 产量增加15%却不影响稻米品质 ；进一步研究发现，1^83131:11的丨8￥6基因在313&口处发生 单碱基缺失造成移码突变而使得翻译提前终止不能形成成熟蛋白，从而通过对源器官的多 效影响增加千粒重从而使水稻增产。TGW6基因编码吲哚乙酸-葡糖糖水解酶，其功能缺失 突变会引起胚乳中吲哚乙酸含量下降，进而使细胞数量增加，粒长变长、粒重增加。
[0003] -直以来，科学家都未发现准确、便捷、高效率的植物基因组编辑的方法。最近 发现的CRISPR/Cas9系统因其简易和有效性已被广泛应用于包括植物在内的多种生物的 基因组编辑中，该系统仅需要短引导RNA和核酸酶就可以对特定生物的靶基因进行定点突 变，为生物定点诱变技术发展注入了新的活力。目前CRISPR/Cas9系统已成功在拟南芥、烟 草、甜橙、水稻、小麦、高粱、玉米以及苔藓植物地钱等植物中实现了定点基因组编辑，但对 水稻育种中有重要价值的产量、品质、育性等关键基因的定向编辑的研究鲜有报道，更缺乏 对相关突变体的育种价值评价。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种水稻千粒重基 因TGW6引导RNA靶点序列，该引导RNA靶点序列可以用于创建水稻千粒重基因tgw6突变 体。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列的应用。
[0006] -种水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列，其寡核苷酸序列为：
[0007] TGW6U3-T1-F :5,-GGCAGCCAGCATCTGGACCTCGG3,；
[0008] TGW6U3-T1-R :5,-AAACCCGAGGTCCAGATGCTGGC3,；
[0009]TGW6U6a-T2-F:5,-GCCGGCTACAGCCATGAGAAGCA3,；
[0010] TGW6U6a-T2-R :5,-AAACTGCTTCTCATGGCTGTAGC3,；
[0011] TGW6U6b-T3-F : 5，-GTTGAGGCAAGCGGCGACCGCGG3，；
[0012] TGW6U6b-T3-R :5,-AAACCCGCGGTCGCCGCTTGCCT3,；
[0013] 所述的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列在编辑水稻基因组中的应用；
[0014] 所述的应用包括将权利要求1所述的引导RNA靶点序列的寡核苷酸链退火形成双 链与载体连接，形成gRNA表达盒；将gRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到三靶点 CRISPR/Cas9-gRNA载体；将三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体转化植物组织，并将转化的植物 组织培育成转基因植株，得到水稻千粒重基因tgw6突变体；
[0015] -种三靶点CRISPR/Cas9_gRNA载体，含有上述靶点序列片段；
[0016] 所述的三靶点CRISPR/Cas9_gRNA载体的制备方法，包含如下步骤：
[0017] 将上述引导RNA靶点序列的寡核苷酸链退火形成双链，然后分别与Bsal酶切后 的pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA和pYL-U6b-gRNA连接，得到三个gRNA表达盒；然后通过 Goldengatecloning的方法将gRNA表达盒全部依次装载到CRISPR/Cas9载体上，得到三 靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体；
[0018] 所述的Goldengatecloning的引物优选为：
[0019]U3-T1-F:5,-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3,；
[0020] U3-T1-R:5,-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3,；
[0021] U6a-T2-F :5,-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3,；
[0022]U6a-T2-R :5'-AGCGTGGGTCTCGTCTTGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
[0023]U6b-T3-F :5'-TTCAGAGGTCTCTAAGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3' ；
[0024] U6b-T3-R :5'-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'；
[0025]所述的CRISPR/Cas9载体优选为pYLCRISPR/Cas9Publ-H ;
[0026] 一种水稻千粒重基因tgw6突变体，是通过将上述三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体 转化植物组织，并将转化的植物组织培育成转基因植株得到的；
[0027] 所述的水稻的品系为H447;
[0028] 所述的H447为R819/玉香占//R819BC2F7代稳定品系，即为先将R819与玉香占杂 交，再将杂交后代与R819回交两次后再自交7代后所得的稳定品系；
[0029] 所述的水稻千粒重基因tgw6缺失突变体在水稻种植领域中的应用。
[0030] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0031](1)本发明提供了一组水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列，该组靶点序列可 以应用于编辑水稻基因组。
[0032] (2)本发明提供的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列，作用于水稻千粒重基 因TGW6三个靶位点，进而实现方便、高效的多重基因组编辑。
[0033] (3)利用本发明提供的水稻千粒重基因TGW6引导RNA靶点序列编辑水稻基因组， 水稻千粒重基因tgw6突变频率在90 %以上，其中50 %多为片段缺失纯合体，有40 %左右是 双等位杂合突变体。
[0034] (4)本发明为快速创建稻米品质（fgr、Chalk5)等生产上有重要应用价值的水稻 优异新种质提供了重要参考，并有望为水稻种质资源创新提供了安全、高效的新途径，具有 重要的理论和实践意义。
【附图说明】
[0035] 图1是TGW6基因靶点序列引物设计及靶点组装示意图，其中，A:3个靶点在TGW6 基因上的位置；B:各gRNA表达盒在载体pYLCRISPR/Cas9Publ-H中的组装方式，黑色方框代 表靶序列引物所在位置。
[0036] 图2是利用TGW6基因靶位点附近的特异引物对突变体的检测结果，其中，M :lkb DNA ladder ;1:水稻材料H447(野生型）；2~22 :tgw6突变体。
[0037] 图3是部分tgw6纯合缺失突变体的突变点的测序分析图，其中"…."示为省 略序列，"一一"示为缺失序列；WT为水稻材料H447,4、18及8分别为tgw6缺失突变体 Cas_tgw6a、Cas_tgw6b及Cas_tgw6 c〇
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0039]载体pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA、pYL-U6b-gRNA以及载体pYLCRISPR/Cas9Publ-H 均由华南农业大学生命科学学院提供（MaX，ZhangQ，ZhuQ，LiuW，ChenY，QiuR，Wang B,YangZ.2015.ArobustCRISPR/Cas9systemforconvenient,high-efficiency multiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.MolPlant,doi:10.1016/ j.molp. 2015. 04. 007)；
[0040] 水稻品系H447为R819/玉香占//R819BC2F7代稳定品系，即为先将R819与玉香占 杂交，再将杂交后代与R819回交两次后再自交7代后所得的稳定品系；
[0041] 实施例1基于CRISPR/Cas9技术的水稻千粒重基因tgw6缺失突变体的创建
[0042] (1)引导RNA(guideRNA，gRNA)靶点序列的设计
[0043] 根据调控水稻粒长及千粒重基因TGW6的基因组序列（GenBank:AB513135. 1)，设 计3个靶向千粒重基因TGW6的gRNA。20nt的寡核苷酸gRNA靶点序列按A/G(N) 20NGG序 列进行设计，同时将设计好的gRNA靶点序列进行水稻基因组数据库比对以排除非特异性 的靶切位点，具体寡核苷酸序列见表1和图1。
[0044] 表1gRNA靶点的寡核苷酸序列
[0045]
[0046] (2)三靶点CRISPR/Cas9-gRNA载体的构建
[0047]参照Ma等人（MaX，ZhangQ,ZhuQ,LiuW,ChenY,QiuR,WangB,YangZ. 2015. ArobustCRISPR/Cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenome editinginmonocotanddicotplants.MolPlant,doi:10. 1016/j.molp. 2015. 04. 007)的 方法，取等量的上游与下游gRNA寡核苷酸链（步骤（1))混合（终浓度1yM)，90°C30sec， 移至室温冷却完成退火形成双链接头；取pYL-U3-gRNA、pYL-U6a-gRNA及pYL-U6b-gRNA 质粒各lyg，在20yL反应体系中用10UBsaI(NEB公司）酶切20min，然后将酶切过的 pYL-U3/U6a/U6b-gRNA载体与各自所对应的双链接头利用T4DNAliagse22°C连接30min 后，得到3个gRNA表达盒（U3、U6a、U6b)，其中，具体连接体系为：
[0048]
[0049] 然后分别用表2中所列各对引物对各个gRNA表达盒（U3、U6a、U6b)进行扩增：
[0050] 表2扩增各靶点gRNA表达盒的引物
[0051]
[0052] 具体的扩增体系为：
[0053]
[0054] 然后进行以下反应：95°Clmin;95°C15sec、55°C15sec、68°C20secl0 循环； 95°C15sec、6(TC15sec68°C20sec17 ~20 循环。
[0055] 将这三个靶点gDNA PCR产物混合后进行PCR产物的纯化，纯化产物经20U Bsal 37°C酶切30min并纯化后，将其与经Bsal酶切的pYLCRISPR/Cas9Publ-H片段利用T4DNA连 接酶20 °C连接约2h，具体连接体系为：
[0056]
[0057] 最后转化DH5a感受态细胞并挑取阳性单克隆（三个片段的连接顺序是 U3-U6a-U6b)后进行测序验证（由Invitrogen公司完成），得到三靶点CRISPR/Cas9-gRNA 载体。
[0058] 实施例2
[0059] (1)农杆菌介导水稻愈伤遗传转化
[0060] 将实施例1组装好的CRISPR/Cas9-gRNA载体通过电击转化到农杆菌 5'-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3'）为阳性的克隆用于侵染水稻水稻材料H447 (R819/玉针 香//R819的BC2F7)的愈伤组织，侵染方法参照Hiei等（1994)的方法进行，获得转基因水 稻植株。
[0061] (2)水稻基因组DNA提取及突变体的PCR检测及测序分析
[0062] 采用CTAB法提取步骤⑴中获得的水稻植株的基因组DNA，对潮霉素基因检测为 阳性的植株利用引物Cas9-TGW6testF及Cas9-TGW6testR对tgw6突变位点进行PCR检测， 其中鉴定引物为：
[0063]Cas9-TGW6-test-F:5'-CAACCAAACCAAAGCCTGC-3,；
[0064]Cas9-TGW6-test-R:5,-CCAATGCCTCATCAACTTAC-3,；
[0065] PCR扩增体系为：
[0066]
[0067]反应条件为：94°C预变性3min ;94°C变性30sec，55°C退火30sec，68°C延伸 60sec，32个循环；68°C延伸5min ;
[0068] 扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳（电泳缓冲液1 X TAE)，BI0RAD凝胶成像系统观 察、照相。结果表明，扩增产物中多为片段缺失纯合体，也有部分双等位杂合突变体存在 (图2)。对PCR产物进行的测序结果分析表明，tgw6突变频率在90%以上，其中50%多为 片段缺失纯合体，有40 %左右是双等位杂合突变体（图3)。
[0069] (4)无转基因成分tgw6突变体的获得及相关性状调查
[0070] 将T。代转基因植株播种成苗，苗期检测潮霉素基因的有无，将不含潮霉素基因而 且tgw6基因位点有缺失的纯合个体（编号