Ssr引物组及利用该引物组进行麦芽品种鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明创造属于生物技术领域，具体涉及一种麦芽品种鉴定的方法，尤其涉及一 种利用SSR引物进行麦芽品种鉴定的技术。
【背景技术】
[0002] 啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的 低酒精度酒。麦芽作为啤酒的主要原料，是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的，麦 芽的质量直接决定啤酒的质量。大麦和麦芽的品种鉴定是评价大麦质量和麦芽质量最重要 的指标，二者均是保证啤酒品质的重要指标。
[0003]目前大麦品种鉴定技术已经相对成熟，既有传统的形态鉴别方法，也有蛋白质电 泳鉴别方法和DNA分子标记法。国标GBT7416-2008中已列出相应的凝胶电泳法和聚合酶 链式反应法。发明专利ZL201210326416. 3公开了"利用SSR引物鉴定大麦品种的方法及其 应用"。该方法包括提取供试品种样品的DNA，用14对基本核心SSR引物和14对扩展核心 SSR引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染及SSR谱带分 析。其中：所述的供试品种样品至少为两个大麦品种，当品种间差异位点数多3,判定为不 同品种；当品种间差异位点数为1或2,判定为近似品种；当品种间差异位点数为0,判定为 疑同品种。该方法可以用于对供试大麦品种与已知大麦品种进行品种鉴定，防止假冒伪劣 品种进入市场。
[0004]与大麦品种鉴定相对成熟的技术相比，麦芽品种鉴定尚无明确的检测方法，常规 的麦芽指标都是反映麦芽混合状态的指标，无法反映麦芽品种的变化。而现有的大麦品种 鉴定的方法并不适用于麦芽品种的鉴定。（1)大麦经发芽和干燥后外观特征已发生变化，且 蛋白质在蛋白酶的作用下开始分解，因此传统的大麦形态鉴别法和蛋白质电泳鉴定的方法 完全不适于麦芽品种的鉴定。（2)在分子标记技术上，大麦DNA通常是从发芽后的新鲜幼苗 叶片中提取得到的，新鲜叶片所含杂质少，DNA提取容易；麦芽是大麦经浸麦、发芽、干燥和 焙焦等制麦工艺后制得的，不能二次发芽，因此只能从麦芽中直接提取DNA。由于麦芽中富 含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大。（3)更为关键的是，麦芽经84-86°C高温焙焦3h 后部分DNA断裂，直接影响PCR扩增片段的结果分析，导致很多在大麦品种鉴定中起决定作 用的引物，经PCR扩增后的产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上电泳条带的形态和位置基本 一致，无法区分相应的麦芽品种。
[0005] 啤酒企业由于缺乏麦芽品种鉴定的技术手段，在麦芽采购时不仅蒙受巨大的经济 损失，而且掺假的麦芽由于均一性差，直接影响糖化、过滤和酿造性能，降低啤酒品质，最终 影响啤酒企业的品牌形象。因此啤酒行业内急需开发一种麦芽品种的鉴定技术，进而从源 头上保障啤酒原料的品质。与大麦相比，麦芽品种鉴定对引物特异性和重现性的要求更高。 因此，必须确定适用于麦芽品种鉴定的新的引物集合，以确保部分DNA链断裂后也不影响 PCR扩增，并能保证扩增的稳定性和重现性。另外，在麦芽品种鉴定中使用的引物数量越少 检测速度越快，检测效率越高，成本降低，才具有广泛的推广和应用价值。
【发明内容】
[0006] 针对现有麦芽品种鉴定所存在的上述问题，本发明提供了一种SSR引物组以及利 用该SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法。
[0007] 本发明的技术方案是：
[0008]SSR引物组，包括6对SSR引物，分别为scssrl0148、Bmac0030、scssr07759、 scssr03907、Bmag0120和HVM68 ;所述6对SSR引物序列如下：
[0009]
[0010] -种利用SSR引物鉴定麦芽品种的方法，包括以下步骤：
[0011] (1)提取供试品种样品的DNA:取单粒麦芽样品于1. 5ml离心管中，约25-45mg，加 入7-8mm钢珠，利用ThmorganCK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65°C预热 的CTAB提取缓冲液600ul，涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质， 分离难度大，因此添加4ul0 -巯基乙醇和1 %PVP(聚乙烯吡咯烷酮），防止多酚氧化褐变 和DNA降解，有效去除多酚和多糖。65°C水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/ 异戊醇（24:1)，涡旋剧烈混匀20s，使成乳状液。室温下，lOOOOrpm离心10分钟，吸取300ul 的上清液到新离心管中，加l〇ul的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体 积的异丙醇，直至白色线状DNA形成块状沉淀。-20°C条件下放置20分钟以上，lOOOOrpm离 心3分钟收集沉淀。加650ul的70%乙醇冲洗液，轻摇几分钟，lOOOOrpm离心2min，弃滤 液。打开盖，平放洁净场所挥发乙醇。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8°C保存DNA。
[0012] ⑵用SSR引物进行PCR扩增：用6对SSR引物分别对供试品种模板DNA进行 PCR扩增，PCR扩增采用20yL的反应体积，含MgCl22. 5mmol/L，dNTP0. 20mmol/L，正向引 物、反向引物各〇. 5ymol/L，TaqDNA聚合酶1.0单位，1XPCR缓冲液（不含Mg2+)，样品 0嫩10-50即。？〇?反应程序为：94°(：预变性3111111 ;94°(：变性308,55°(：退火308,72°(：延伸 lmin，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0013] (3)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染：取6%非变性聚丙烯酰胺溶液80mL，加入 TEMED80yL和10%过硫酸胺800yL，混合均匀，制胶；电泳槽中加1XTBE缓冲液，样品孔 中加入0. 5-1y1的PCR扩增产物；电泳条件为恒定电压110V，电泳时间2h。银染过程包 括，超纯水水洗两次，各2分钟，0. 1 %硝酸银溶液银染10min，超纯水水洗2min，显影液显色 10min，直至条带清晰，超纯水再次水洗两次。
[0014] (4)电泳条带分析：在相同迀移率位置上进行"1、0"标注，扩增出条带的记为1，未 扩增出条带的记为〇,构建出SSR引物对供试样品的SSR分析谱带数据；品种间差异位点数 多1，即判定为不同品种；品种间差异位点数为〇,判定为相同品种形成鉴定结果。
[0015] -种上述方法的应用，通过6对SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，对供试麦 芽品种与已知麦芽品种进行品种鉴定。
[0016] -种上述方法的另一种应用，利用6对SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，构 建麦芽品种数据库。
[0017]本发明的有益效果是：本发明采用特异性的SSR引物组进行麦芽品种鉴定，特异 性高，扩增效率好，能快速鉴定麦芽的不同品种，具有快速、操作方便等优势，并且鉴定结果 不易受环境影响。该方法可以防止麦芽掺假问题的出现，能够从源头上保障麦芽的品质，进 而保证啤酒的品质，维护啤酒企业的品牌形象。
【附图说明】
[0018] 图1为引物scssrl0148下21种麦芽的电泳图谱；
[0019] 图2为引物Bmac0030下21种麦芽的电泳图谱；
[0020] 图3为引物scssr07759下21种麦芽的电泳图谱；
[0021] 图4为引物scssr03907下21种麦芽的电泳图谱；
[0022] 图5为引物Bmag0120下21种麦芽的电泳图谱；
[0023] 图6为引物HVM68下21种麦芽的电泳图谱；
[0024] 图7为通过6对引物对麦芽品种Copeland进行鉴定的电泳图谱；
[0025] 图8为通过6对引物对麦芽品种Metcalfe进行鉴定的电泳图谱；
[0026] 图9为通过6对引物对麦芽品种甘啤4进行鉴定的电泳图谱；
[0027]其中，图1中21种麦芽依次为：Copeland、Metcalfe、Newdale、Meredith、 Gairdner、Hindmarsh、Commander、Flagship、Sloop、Prestige、星啤7、Buloke、Vlamingh、 Hamelin、单2、港啤、Kendall、Baudin、Sebastian、Cervoise和甘啤4 ;
[0028] 图2中21中麦芽依次为：Copeland、Metcalfe、Newdale、Kendall、Meredith、 Gairdner、Commander、Sloop、港啤、Hindmarsh、Hamel in、Buloke、Cervoise、甘啤4、星啤7、 单2、Sebastian、Prestige、Baudin、Vlamingh和Flagship ;
[0029] 图3中21中麦芽依次为：Metcalfe、Newdale、Kendall、Baudin、Gairdner、 Hindmarsh、Buloke、Sloop、Prestige、Meredith、Vlamingh、Sebastian、Commander、 Copeland、Hamelin、Flagship、Cervoise、甘啤4、星啤7、单2和港啤；
[0030] 图4中21中麦芽依次为：Cervoise、Gairdner、Buloke、Prestige、Baudin、 Vlamingh、Commander、Sloop、Sebastian、星啤7、单2、Hindmarsh、Copeland、Metcalfe、 Newdale、Kendall、Meredith、Hamelin、Flagship、甘啤4和港啤；
[0031] 图5中21中麦芽依次为：星啤7、Gairdner、Vlamingh、Hamelin、Sebastian、 单2、Copeland、Newdale、Kendall、Meredith、Flagship、Prestige、Metcalfe、Baudin、 Hindmarsh、Commander、Buloke、Sloop、Cervoise、甘啤4和港啤；
[0032]图6中21中麦芽依次为：&3卩61&]1(1、如￥(1&16、卩1&88111卩、13111〇1^、港啤、]\161：0&1作、 Hindmarsh、Sloop、Cervoise、甘啤4、星啤7、Gairdner、Vlamingh、Commander、Kendall、 Meredith、Baudin、单2、Hamelin、Sebastian和Prestige。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图对本发明做进一步的说明。
[0034] 实施例1:
[0035] 选择21种不同产地的大麦样品，经发芽、干燥后制成麦芽。
[0036] 表1. 21种麦芽样品
[0037]
[0038] (1)提取供试品种样品的DNA
[0039] 采用CTAB法提取供试品种样品的DNA:取单粒麦芽样品于1. 5ml离心管中，约 25-45mg，加入7-8mm钢珠，利用ThmorganCK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加 入65°C预热的CTAB提取缓冲液600ul，涡旋混匀裂解样品。添加4ul0 -巯基乙醇和1 % PVP(聚乙烯吡咯烷酮），防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多酚和多糖，涡旋混匀。 65°C水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇（24 :1)，涡旋剧烈混匀20s， 使成乳状液。室温下，lOOOOrpm离心10分钟，吸取300ul的上清液到新离心管中，加10ul 的RNaseA放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线状DNA形 成块状沉淀。-20°C条件下放置20分钟以上，lOOOOrpm离心3分钟收集沉淀。加650ul的 70%乙醇冲洗液，轻摇几分钟，lOOOOrpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放洁净场所挥发乙 醇。加适量TE缓冲液，在4°C溶解DNA，放置过夜，2-8°C保存DNA