。（2)用SSR引物进行PCR 扩增
[0040] 用6对SSR引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增，采用20yL的反应体积， 含MgCl22. 5mmol/L，dNTP0. 20mmol/L，正向引物、反向引物各 0. 5ymol/L，TaqDNA聚合酶 1. 0单位，1XPCR缓冲液（不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94°C预变性3min; 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，共30个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0041] (3)聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染
[0042] 采用6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR引物扩增产物的多态性。
[0043] 清洗玻璃板：用自来水沾取洗涤剂将玻璃板反复擦洗，用清水冲洗干净后晾干。先 用乙醇擦拭玻璃板3次，晾干。母板玻璃板用亲和硅烷擦拭3次，耳板玻璃板用剥离硅烷擦 拭3次，每次间隔5min，自然干燥。
[0044] 凝胶准备：玻璃板组装，水平放置，等待灌胶。配置6 %的非变性聚丙烯胺凝胶 80ml，分别加入TEMED80yL和10%过硫酸胺800yL，用注射器小心将凝胶注入玻璃板中， 避免形成气泡。然后在灌胶口插上梳子，聚合约40min。将玻璃板放入电泳槽中组装，加入 0. 5XTBE缓冲液，液面高于齿孔2cm，小心拔掉梳子。上样：每孔点样lul。电泳：于110V 恒压电泳2h。
[0045] 硝酸银染色：超纯水水洗两次，各2分钟；0. 1 %硝酸银溶液（0.5g AgN03,加蒸馏 水定容至500ml)银染lOmin，超纯水水洗2分钟；显影液（7.5g NaOH，0.25g四硼酸钠，2ml 甲醛，加蒸馏水定容至500ml)显色10分钟，直至条带清晰，超纯水再次水洗两次即可。
[0046] (4)电泳条带分析：在相同迀移率位置上进行"1、0"标注，扩增出条带的记为1，未 扩增出条带的记为〇,构建出SSR引物对供试样品的SSR分析谱带数据。（5)结果分析：利 用6对SSR引物构建出21种麦芽样品的SSR电泳图谱。图1-6为6对核心SSR引物用于 21种麦芽品种的SSR电泳图谱。根据多倍体SSR标记的读带方法，按整体带型的相似度来 读带，从1开始按序进行标记。由图3可知，引物SCSSr07759总体上可将21种麦芽分成四 类，其中Copeland、Commander、Hamelin、Flagship、Cervoise、甘啤 4、星啤 7、单 2、港啤为 第一类，Prestige、Meredith、Vlamingh、Sebastian为第二类，Sloop为第三类，Metcalfe、 Newdale、Kendall、Baudin、Gairdner、Hindmarsh、Buloke为第四类。由图 6 可知，引物 HVM68总体上可将21种麦芽分成十类，其中Kendall、Baudin、Prestige和单2为第一类， Meredith为第二类，Hamelin为第三类，Sebastian为第四类，Gairdner和Commander为第 五类，Vlamingh为第六类，Metcalfe、Hindmarsh、Sloop、Cervoise、甘啤 4、星啤 7 为第七 类，Copeland和Newdale为第八类，Flagship和Buloke为第九类，港啤为第十类。其他引 物的电泳图谱，分别见图3-6。从所得数据可以看出，6对特异性SSR引物可以把这21种麦 芽品种完全区分开。
[0047] 表2. 21种麦芽的等位基因位点分析
[0048]
[0049] *注：根据多倍体SSR标记读带方法，按整体带型的相似度来读带，位置最低处标 记为1，按序进行标记。
[0050] 该麦芽品种鉴定方法成本低、操作方便，可有效地对啤酒企业使用的麦芽品种真 伪进行监控，好麦芽生产好啤酒。
[0051] 实施例2:
[0052] 样品包括2份供试麦芽品种，一份为对照品种Copeland共2粒，另一份为待鉴定 麦芽品种A共6粒，确定品种A是否是Copeland。
[0053] (1)对样品进行麦芽DNA制备，利用6对SSR引物进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶 电泳，银染，图谱分析，具体实施步骤如实施例1的（1)-(4)。
[0054] (2)结果分析：由图7可知，泳道1-8为第一对引物scssrl0148,泳道1、2为对照品 种Copeland，泳道3-8为待鉴定品种，其中泳道3、5、6、7的电泳条带与泳道1、2对照样品的 电泳条带完全一致，而泳道4、8的电泳条带与对照样品Copeland不同，由此可确定泳道4、8 为其它品种。泳道9-16为第二对引物Bmac0030,泳道17-24为第三对引物scssr07759,泳 道25-32为第四对引物为scssr03907,泳道33-40第五对引物为Bmag0120,泳道41-48为第 六对引物HVM68。从所得的电泳图谱可以看出，这两份麦芽样品在Bmac0030、scssr07759、 scssr03907、Bmag0120、HVM68的5个SSR位点上完全一致，但在scssrl0148位点上存在差 异，从而可以确定6个待鉴定麦芽样品中4个为Copeland，2个为其它麦芽品种。
[0055] 实施例3 :
[0056] 样品包括2份供试麦芽品种，一份为对照品种Metcalfe共2粒，另一份为待鉴定 麦芽品种B共6粒。
[0057] (1)对样品进行麦芽DNA制备，利用6对SSR引物进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶 电泳，银染，图谱分析，具体实施步骤如实施例1的步骤（1)-(4)。
[0058] (2)结果分析：由图8可知，泳道1-8为第一对引物scssrl0148,泳道1、2为对照 品种Metcalfe，泳道3-8为待鉴定品种，其中泳道4-8的电泳条带与泳道1、2对照样品的电 泳条带完全一致，而泳道3的电泳条带与对照样品Metcalfe不同，由此可确定泳道3为其 它品种。泳道9-16为第二对引物Bmac0030,泳道9、10为对照品种Metcalfe，泳道11-16 为待鉴定品种，其中泳道12、13、14、16的电泳条带与泳道9、10对照样品的电泳条带完全一 致，而泳道11、15的电泳条带与对照样品Metcalfe不同，由此可确定泳道11、15为其它品 种。泳道17-24为第三对引物scssr07759,泳道25-32为第四对引物为scssr03907,泳道 33-40第五对引物为Bmag0120,泳道41-48为第六对引物HVM68。从所得的电泳图谱可以看 出，这两份麦芽样品在scssrl0148、Bmac0030、scssr03907、Bmag0120、HVM68的5个SSR位 点上均存在差异，从而可以确定6个待鉴定麦芽样品中4个为Metcalfe，2个为其它麦芽品 种。
[0059] 实施例4 :
[0060] 样品包括2份供试麦芽品种，一份为对照品种甘啤4共2粒，另一份为待鉴定麦芽 品种C共6粒。
[0061] (1)对样品进行麦芽DNA制备，利用6对SSR引物进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶 电泳，银染，图谱分析，具体实施步骤如实施例1的步骤（1)-(4)。
[0062] (2)结果分析：由图9可知，泳道1-8为第一对引物scssrl0148,泳道1、2为对照品 种甘啤4,泳道3-8为待鉴定品种，其中泳道3、4、5、6、8的电泳条带与泳道1、2对照样品的 电泳条带完全一致，而泳道7的电泳条带与对照样品甘啤4不同，由此可确定泳道7为其它 麦芽品种。泳道9-16为第二对引物Bmac0030,泳道9、10为对照样品甘啤4,泳道11-16为 待鉴定品种，其中泳道11-16的电泳条带与泳道9、10对照样品的电泳条带完全一致，说明 该品种疑似对照样品甘啤4。泳道17-24为第三对引物scssr07759,泳道25-32为第四对引 物为scssr03907,泳道33-40为第五对引物为Bmag0120,泳道41-48为第六对引物HVM68。 从所得的电泳图谱可以看出，这两份麦芽样品在scssrl0148、scssr07759、scssr03907、 Bmag0120的4个SSR位点上均存在差异，从而可以确定6个待鉴定麦芽样品中5个为甘啤 4,有1个为其它麦芽品种。
【主权项】
1. SSR引物组，其特征在于：包括6对SSR引物，分别为scssrl0148、Bmac0030、 scssr07759、scssr03907、Bmag0120 和 HVM68 ;所述 6 对 SSR 引物序列如下：2. 利用权利要求1所述的SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：包括以 下步骤：（1)提取供试品种样品的DNA ; (2)用SSR引物进行PCR扩增；（3)聚丙烯酰胺凝胶 电泳及银染；（4) SSR谱带分析。3. 根据权利要求2所述的利用SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：所 述麦芽包括以下21种麦芽：4. 根据权利要求3所述的SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：所述步 骤⑵中PCR扩增的反应程序为94°C预变性3min ;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 lmin，共30个循环；最后72°C延伸10min，4°C保存。5. 根据权利要求3所述的SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：所述PCR 扩增体系采用20 μ L的反应体积，包括2. 5mmol/L的MgCl2、0. 20mmol/L的dNTP以及正向 引物、反向引物各〇. 5 μ mol/L，Taq DNA聚合酶I. 0单位，IXPCR缓冲液（不含Mg2+)，样品 DNA 10-50ng〇6. 根据权利要求3所述的SSR引物组进行麦芽品种鉴定的方法，其特征在于：所述步 骤（3)为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，具体步骤包括：(a)取6%非变性聚丙烯酰胺 溶液80mL，加入TEMED 80 μ L和10 %过硫酸胺800 μ L，混合均勾，制胶；(b)电泳槽中加 IXTBE缓冲液，样品孔中加入0. 5-1 μ 1的PCR扩增产物；电泳条件为恒定电压110V，电泳 时间2h ; (3)银染：超纯水水洗两次，每次2分钟，0. 1%硝酸银溶液银染lOmin，超纯水水 洗2min，显影液显色lOmin，直至条带清晰，超纯水再次水洗两次；所述步骤（4) SSR谱带分 析为：在相同迀移率位置上进行"1、〇"标注，扩增出条带的记为1，未扩增出条带的记为〇， 构建出SSR引物对供试样品的SSR分析谱带数据；品种间差异位点数多1，即判定为不同品 种；品种间差异位点数为0,判定为相同品种形成鉴定结果。7. -种权利要求2或3所述方法的应用，其特征在于：通过6对SSR引物PCR扩增后 进行SSR谱带分析，对供试麦芽品种与已知麦芽品种进行品种鉴定。8. -种权利要求2或3所述方法的应用，其特征在于：利用6对SSR引物PCR扩增后 进行SSR谱带分析，构建麦芽品种数据库。
【专利摘要】本发明提供了一种SSR引物组，包括6对SSR引物，分别为scssr07759、HVM68、Bmac0030、scssr10148、scssr03907和Bmag0120。本发明还提供了一种利用SSR引物鉴定麦芽品种的方法，包括以下几个步骤：提取供试品种样品的DNA、用SSR引物进行PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染和SSR谱带分析。通过6对SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，可以对供试麦芽品种与已知麦芽品种进行品种鉴定，也可以构建麦芽品种数据库。本发明采用特异性的SSR引物组进行麦芽品种鉴定，能快速鉴定麦芽的不同品种，具有快速、准确、操作方便的优势。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105063027
【申请号】CN201510465161
【发明人】董建军, 张志军, 林艳, 余俊红, 岳杰, 房莉, 周月南, 祁明霞, 张翠
【申请人】青岛啤酒股份有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月31日