专利名称：：辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法及其专用引物。
背景技术：
：小麦是世界上最重要的粮食作物之一，它提供的热量和蛋白占人类营养成分的20%以上，全世界有超过35%的人口以小麦为主粮。我国的小麦种植面积、总产和消费量居世界首位，其产量约占我国粮食总产量的1/5。提高小麦产量是小麦育种的一个重要目标。小麦的单位面积产量是由单位面积穗数、每穗粒数和平均粒重构成的。千粒重在产量构成因素中对产量的直接贡献最大，在群体条件下提高平均单穗粒重是提高品种群体产量潜力的关键。研究表明不同类型小麦品种(多穗型、中间型和大穗型)千粒重每增加l个单位(g)，产量分别增加151、157和147kg。小麦产量的高低总是伴随着粒重的高低而同步变化的，在增产年份中，粒重占增产因素的比重达87.4%;而在减产年份，因粒重下降造成产量下降占到94.2%。千粒重在产量构成因素中受遗传特征的影响最大，其遗传主要受加性效应的基因控制，广义遗传力高达59-80%。也有研究结果表明千粒重受三组基因控制，一些微效基因起一定辅助作用。小麦籽粒粒重受多种因素影响，其中灌浆是影响小麦生长、发育的重要生理过程，其持续时间和速率决定小麦籽粒大小或重量，但灌浆持续时间和灌浆速率受品种、环境、栽培措施等条件的影响。有研究认为小麦籽粒最大粒重主要由灌浆速率和灌浆持续期来决定，但也有研究表明灌浆速率的影响大于灌浆持续时间。不同小麦品种籽粒粒重的差异很大，而其差异主要是由灌浆速率不同引起的，而灌浆速率主要受遗传因素控制，是高产育种的重要选择指标。但多年来一直无法直接对籽粒灌浆性状及其基因进行有效选择，成为育种的瓶颈问题。中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，在筛选水稻遗传资源的基础上，通过构建遗传定位群体，成功分离了控制水稻籽粒发育中蔗糖运输卸载和灌浆的关键功能基因GIF1，研究表明GIF1是水稻驯化过程中起重要作用的一个基因。人工选择可以使现代栽培稻的GIF1基因有严格的组织表达特异性，有利于籽粒灌浆，使水稻产量提高。GIF1基因是控制蔗糖转化酶的一种基因。光合产物以蔗糖的形式被运输到籽粒中，而转化酶可将光合产物的蔗糖不可逆地裂解形成葡萄糖和果糖，植物酸性转化酶主要有两大类一类结合于细胞壁上，称之为细胞壁结合的转化酶(cellwall—boundinvertase，CWI)，另一类存在于液泡中，称之为可溶性酸性转化酶(solubleacidinvertase，SAI)。在所有形式的转化酶中，不溶性转化酶(即CWI)是库器官形成中决定库强的一个关键酶。玉米芯和胚乳中CWI活性缺失的玉米突变体，在早期籽粒形成阶段，籽粒生长即明显受到抑制，成熟时，粒重只有正常籽粒的l/5。对转基因胡萝卜的研究表明，降低CWI活性，植株不能形成主根。CWI在大麦籽粒形成早期的时空表达和蔗糖运输的一致性，表明其在碳水化合物分配方面起到关键作用。对水稻中0sCINl基因的RNA原位杂交表明，CWI在籽粒形成阶段中对碳水化合物的供应起决定作用。Sturm和Chrispeels(1990)首先从胡萝卜中分离出了细胞壁结合转化酶(CWI)基因，随后在马铃薯、拟南芥、烟草、番茄和葡萄等植物中也分离到编码该酶的全长或部分的核苷酸序列。目前，有关GIF基因在小麦中的克隆并没有报道。功能标记(Functionalmarker)是一类基于基因特征序列开发的标记，与目标基因共分离，大大提高了选择的准确性，在MAS中有着广泛应用前景。而小麦千粒重是一个数量性状，受基因型、环境及其互作的影响。因此，克隆和开发小麦GIF基因对小麦高产育种具有重要意义。
发明内容本发明的目的是提供辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法及其专用引物。本发明提供的辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法，包括如下步骤以小麦基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果引物对甲的扩增产物中具有402bp的DNA片段且引物乙的扩增产物中不具有404bp的DNA片段，待测小麦的基因型为TaCwi-Ala;如果引物对乙的扩增产物中具有404bp的DNA片段且引物甲的扩增产物中不具有402bp的DNA片段，待测小麦的基因型为TaCwi-Alb;基因型为TaCwi-Ala的小麦的千粒重在统计学上大于基因型为TaCwi-Alb的小麦品种；所述引物对甲由序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成；所述引物对乙由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成。本发明还保护序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对甲。本发明还保护序列表的序列5所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对乙。本发明同时保护所述引物对甲和/或所述引物对乙在制备辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒中的应用。本发明还保护一种辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒，包括所述引物对甲和/或权利要求3所述引物对乙。所述方法，所述应用，所述试剂盒中，所述小麦可为普通小麦。本发明还保护序列表的序列6所示DNA、序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物。所述方法，所述引物对甲，所述引物对乙，所述试剂盒和所述引物组合物均可应用于小麦育种。本发明还保护如下(a)或(b)或(c)或(d)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦千粒重性状相关的由序列1衍生的蛋白质；(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦千粒重性状相关的由序列3衍生的蛋白质。编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围，所述基因是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列4所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码小麦千粒重性状相关蛋白的DNA分子；4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码小麦千粒重性状相关蛋白的DNA分子。本发明所提供的蛋白及其编码基因，与小麦籽粒粒重性状有着紧密的相关性。本发明还提供了基于该小麦粒重高低相关蛋白基因等位变异的特异性功能标记，利用该标记可以对小麦粒重高低相关基因的变异进行分子标记辅助选择，从而培育高粒重的优良小麦品种，避免筛选粒重较低的小麦品种。应用本发明提供的蛋白及其编码基因以及功能标记辅助选择，可在发育早期筛选小麦品种，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本。本发明提供的检测小麦粒重高低的方法操作简单，可以避免环境等因素对小麦籽粒粒重的影响、稳定可靠，对快速小麦高产育种具有重要的理论意义和经济价值。本发明对小麦籽粒粒重的基因工程改良将起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒粒重的遗传和分子生物学的进一步研究，对高产小麦品种的培育也具有重大意义。图1为来源于普通小麦的2个籽粒粒重相关蛋白TaCwi-Ala与TaCwi-Alb的序列对比。图2为CWI21/CWI22标记对14个不同粒重材料的多态性检测。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。所有引物合成均由北京奥科生物公司完成。实施例中所用小麦材料均获自中国农业科学院作物科学研究所的国家种质库。实施例1、与小麦籽粒粒重相关的蛋白及其编码基因的获得—、TaCwi-Ala蛋白及其编码基因的获得TaCwi-Ala蛋白编码基因的获得采取电子克隆结合常规PCR扩增的方法。根据水稻粒重相关基因GIF基因(GenBankAccessionNumber:EU095553)在小麦EST数据库中进行BLAST检索，将筛选得到的EST分别进行拼接，随后根据CK206103、CD927722、CJ673133、D927242电子拼接得到的全长CWI基因，采用PrimierPrimer5软件设计3对引物Cl、C2、C3，从小麦品种豆麦的基因组DNA中获得真正的CWI基因序列。PCR反应以小麦基因组DNA为模板，在MJResearchPTC-200PCR仪上进行，20ii1PCR反应体系为模板DNA50ng，Taq酶1U(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(5iimo1L—0各l.Oii1，dNTP(25iimo1L—"0.2ii1，10XPCR缓冲液2iil，用无菌蒸馏水补充反应体系至20iU。PCR反应采用步降(Touchdown)退火程序首先95°C5min;然5后95。C60s，由66。C开始，每个循环的退火温度降低0.3。C，退火时间lmin30s，72。C2min，共40个循环；最后72°C10min，4t:保温。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，采用缓冲体系为1XTAE溶液，用北京'六一'厂的DYC-34A型电泳槽，200V电压电泳30分钟，O.5%溴化乙锭(Ethidiumbromide,EB)染色10分钟，蒸馏水漂洗后在MultiGeniusBio-ImagingSystem成像系统上用紫外灯扫描成像并存入计算机。在紫外灯下将目标带挖下来，克隆至pMD18-T载体上进行测序。测序由上海生工生物工程技术服务有限公司(http://www.sangon.com)完成。为了保证Cl、C2、C3扩增片段位于2A染色体上，每对引物都要在中国春缺体_四体系N2A-T2B、N2B-T2A和N2D-T2B中验证，以确保其PCR扩增的基因组专一性。为防止PCR过程中和测序过程中发生碱基错配和误读，每个PCR反应和测序反应都要重复2到4次，每一段序列只有在至少两次测序结果完全一样的情况下才能最终确定，否则还要继续测定。序列比对采用DNAMAN软件(http:〃www.lynnon.com)进行，得到用于扩增2A染色体上CWI基因全长的三对引物(表l)。基因组中内含子的位置根据GIF基因的mRNA序列和基因组DNA的序列比对来确定。确定其内含子区及起始密码子和终止密码子，并将外显子进行拼接，翻译获得TaCwi-Ala蛋白序列。表1用于扩增小麦2A染色体上TaCwi基因全长的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>TaCwi-Ala蛋白的序列如序列表的序列1所示，编码基因如序列表的序列2所示。二、TaCwi-Alb蛋白及其编码基因的获得TaCwi-Alb蛋白及其编码基因的获得与TaCwi-Ala的获得方法完全相同，所用小麦品种为洋小麦。TaCwi-Alb蛋白的序列如序列表的序列3所示，编码基因如序列表的序列4所示。实施例2、小麦籽粒粒重性状与基因型的相关性分析—、功能标记引物的设计根据序列表中的序列2、序列4设计两组引物CWI21(引物对乙；P1/P2)和CWI22(引物对甲；P3/P2)如下Pl(上游引物)5'-GTGGTGATGAGTTCATGGTTAAG-3'(序列5);P3(上游引物)5'-GGTGATGAGTTCATGGTTAAT-3'(序列6)P2(下游引物)5'-AGAAGCCCAACATTAAATCAAC-3'(序列7)。用引物对乙，可以扩增序列表中序列4所示核苷酸中404bp的DNA片段，不能扩增序列表中序列2所示核苷酸中的DNA片段；用引物对甲可以扩增序列表中序列2所示核苷酸中402bp的DNA片段，不能扩增出序列表中序列4所示核苷酸中的DNA片段。二、小麦籽粒粒重与所述基因的相关性分析材料I:192份中国冬小麦栽培品种(2001年种植于河南安阳)；材料II:117份中国冬小麦栽培品种(2008年种植于四川成都)；材料III:130份中国冬小麦农家品种(2008年种植于四川成都)；材料IV:48份中国冬小麦农家品种(2008年种植北京)。1、小麦籽粒千粒重的测定按GB/T5519-2008检测小麦籽粒千粒重。2、小麦基因型的测定提取各个小麦的基因组DNA，分别按以下步骤进行检测①以小麦基因组DNA为模板，分别用CWI21和CWI22进行PCR扩增。PCR反应体系模板DNA50ng，Taq酶1U(北京天根生化科技公司)，上、下游引物(5iimo1L—0各lyl，dNTP(25iimo1L—"0.1，10XPCR缓冲液2yl，用无菌蒸馏水补充反应体系至20iU。PCR反应程序首先95。C、5min;然后95。C、lmin，58。C(CWI21)或60°C(CWI22)、lmin，72t:、lmin20s，共40个循环；最后72°C、8min。扩增产物于4"C保存。②将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。图2为14个样本的鉴定结果；泳道M表示分子量标准(Marker);泳道01至14分别为以下品种的小麦豆麦、中麦9号、川麦39、SW18390、内麦8、山农664、川麦43，凤麦24、石4185、临旱917、豫麦21、绵阳26、川农16、扬麦10;A为CWI22扩增结果，B为CWI21扩增结果。如果用引物对乙扩增出404bp的条带，而同时用引物对甲扩增不出402bp的条带，说明基因型为TaCwi-Alb;如果引物对甲扩增出402bp的条带，而用引物对乙没有扩增出404bp的条带，说明基因型为TaCwi-Ala。材料I的192个样本中，146个样本的基因型为TaCwi-Ala，46个样本基因型为TaCwi-Alb。材料I中的小麦的品种、来源、千粒重测定结果和基因型分析结果见表2。材料II的117个样本中，102个样本的基因型为TaCwi-Ala，15个样本的基因型为TaCwi-Alb。材料II中的小麦的品种、来源、千粒重测定结果和基因型分析结果见表3。材料III的130个样本中，5个样本的基因型为TaCwi-Ala，125个样本的基因型为TaCwi-Alb。材料III中的小麦的品种、来源、千粒重测定结果和基因型分析结果见表4。材料IV的48个样本中，5个样本的基因型为TaCwi-Ala，43个样本的基因型为TaCwi-Alb。材料IV中的小麦的品种、来源、千粒重测定结果和基因型分析结果见表5。表2材料I192份中国冬小麦品种千粒重测定结果和基因型分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>基因型分析结果a:TaCwi-Ala;b:TaCwi-Alb千粒重(g)108扬麦1337.7109省预26b37.0110省预6036.0111省预4435.0112川育1232.6113扬麦9号30.0114扬麦15828.9115扬麦10号b27.3116绵阳1126.3117繁六25.8表4材料III中130份小麦品种千粒重测定结果和基因型分析结果编号品种名称基因型分析结果a:TaCwi-Ala;b:TaCwi-Alb千粒重(g)1彰明鱼尾兰麦a47.02平武一根麦b45.53小红麦b41.54白老来变b40.55红春麦b40.06金黄麦b40.024<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>对不同基因型小麦的籽粒粒重进行统计分析，发现有显著差异，见表6。表6小麦等位变异与籽粒粒重高低关系的统计分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>通过小麦千粒重与所述基因的相关性分析，得出以下结论以小麦基因组DNA为模板，分别用引物甲和引物对进行扩增，如果用引物对乙扩增出404bp的条带，而同时用引物对甲扩增不出402bp的条带，说明基因型为TaCwi-Alb，具有低千粒重；如果用引物对甲扩增出402bp的条带，而用引物对乙没有扩增出404bp的条带，说明基因型为TaCwi-Ala，具有高千粒重。基因型为TaCwi-Ala的小麦品种的千粒重在统计学上大于基因型为TaCwi-Alb的小麦品种。权利要求辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法，包括如下步骤以小麦基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果引物对甲的扩增产物中具有402bp的DNA片段且引物乙的扩增产物中不具有404bp的DNA片段，待测小麦的基因型为TaCwi-A1a；如果引物对乙的扩增产物中具有404bp的DNA片段且引物甲的扩增产物中不具有402bp的DNA片段，待测小麦的基因型为TaCwi-A1b；基因型为TaCwi-A1a的小麦的千粒重在统计学上大于基因型为TaCwi-A1b的小麦品种；所述引物对甲由序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成；所述引物对乙由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成。2.序列表的序列6所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对甲。3.序列表的序列5所示DNA和序列表的序列7所示DNA组成的引物对乙。4.权利要求2所述引物对甲和/或权利要求3所述引物对乙在制备辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒中的应用。5.辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的试剂盒，包括权利要求2所述引物对甲和/或权利要求3所述引物对乙。6.如权利要求1所述方法，如权利要求4所述应用，如权利要求5所述试剂盒，其特征在于所述小麦为普通小麦。7.序列表的序列6所示DNA、序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA组成的引物组合物。8.权利要求1所述方法，权利要求2所述引物对甲，权利要求3所述引物对乙，权利要求5所述试剂盒或权利要求7所述引物组合物在小麦育种中的应用。9.如下(a)或(b)或(c)或(d)的蛋白质:(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦千粒重性状相关的由序列1衍生的蛋白质；(d)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与小麦千粒重性状相关的由序列3衍生的蛋白质。10.编码权利要求9所述蛋白质的基因，是如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)序列表中序列4所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码小麦千粒重性状相关蛋白的DNA分子；4)与l)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性且编码小麦千粒重性状相关蛋白的DNA分子。全文摘要本发明公开了一种辅助鉴定具有不同千粒重性状小麦的方法及其专用引物。本发明提供的方法，包括如下步骤以小麦基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增；如果引物对甲的扩增产物中具有402bp的DNA片段且引物乙的扩增产物中不具有404bp的DNA片段，待测小麦的基因型为TaCwi-A1a；如果引物对乙的扩增产物中具有404bp的DNA片段且引物甲的扩增产物中不具有402bp的DNA片段，待测小麦的基因型为TaCwi-A1b；基因型为TaCwi-A1a的小麦的千粒重在统计学上大于基因型为TaCwi-A1b的小麦品种。本发明可以用于培育高千粒重的优良小麦品种，避免筛选千粒重较低的小麦品种。可在发育早期筛选小麦品种，从而优化杂交组合，加快育种速度，降低育种成本。文档编号C12N15/29GK101768643SQ20101012775公开日2010年7月7日申请日期2010年3月17日优先权日2010年3月17日发明者何中虎,夏先春,马冬云申请人:中国农业科学院作物科学研究所