一种调控植物农艺性状或产量性状形成的多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种调控植物农艺性状和产量性状形成的多肽及其应用。本发明通过在植物中定向调控该细胞分裂素-O-葡糖糖基转移酶1的表达水平，改变植物的根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数以及籽粒形态和千粒重等农艺性状和产量性状，进而达到改良植物株型、穗型结构和籽粒形态及重量，增加产量等目的。
【专利说明】一种调控植物农艺性状或产量性状形成的多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】；更具体地，本发明涉及调控植物主要农艺性状或产量 性状形成的多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着全球耕地面积的逐年减少，农作物的产量难以维持人类的发展。虽然粮食作 物的亩产在增加，但总产量难以维持增势。根据联合国粮农组织发布的报告，全球面临较大 的粮食危机。一些主要粮食作物、油料作物的品种改良显得极为迫切。
[0003] 水稻（Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物之一，世界上超过一半人口，包 括几乎整个东亚和东南亚的人口，都以稻米为食。因此，增加水稻产量对于解决世界粮食安 全问题有着重大的意义。一般来说，影响水稻产量的直接因素主要包括粒重，单穗粒数，单 株穗数（近似于单株分蘖数），结实率这几个方面。除此之外，还包括株高、分蘖等间接因 素。因此，通过改变这些因素来促进水稻产量的增加在现代农业生产上有着广泛的应用前 旦 -5^ 〇
[0004] 利用生物技术进行品种改良已逐步取代传统的育种方式成为获得高产优质农作 物及经济作物等的方法。因此，寻找那些可以调控植物相关性状的作用基因就成为利用生 物技术提高作物产量的重要前提。
[0005] 因此，本领域迫切需要进一步开发可应用于改良植物、使植物高产的新的途径，从 而实现对农作物、经济作物及花卉等植物的定向改良，获得适合人们需要的植物新品种。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种调控植物农艺性状或产量性状形成的多肽及其应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种调控植物（如作物）农艺性状和/或产量性状的 方法，所述方法包括：调节植物中细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的表达。
[0008] 在一个优选例中，所述的植物是禾本科植物；较佳地，所述的禾本科植物是水稻， 小麦、玉米、黑麦、高粱；和/或
[0009] 所述的农艺性状或产量性状包括：根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗 籽粒数、籽粒形态和/或千粒重。
[0010] 在另一优选例中，所述的细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1选自下组：
[0011] (a)如SEQ ID N0:3氨基酸序列的多肽；
[0012] (b)将SEQ ID N0:3氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个；较佳地1-10 ;更佳 地1-5个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的 多肽；或
[0013] (c)与（a)限定的多肽序列有80%(较佳地90% ;更佳地95% ;更佳地98%)以上同 源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽。
[0014] 在另一优选例中，所述方法包括：降低植物（如作物）中细胞分裂素 -0-葡糖糖基 转移酶1的表达；从而：
[0015] 增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝和单穗籽粒数；
[0016] 提高植物种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重
[0017] 促进植物的分蘖能力；
[0018] 促进植物茎叶生长；
[0019] 增加植物株高；
[0020] 适度延迟植物灌浆期旗叶的衰老；
[0021] 促进植物根系发育和不定根生成；
[0022] 降低植物侧根密度；和/或
[0023] 降低植物中cZOG的含量。
[0024] 在另一优选例中，所述降低植物中细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的表达包括： 将下调细胞分裂素-〇-葡糖糖基转移酶1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入植 物中；较佳地，所述的下调剂是特异性干扰细胞分裂素-〇-葡糖糖基转移酶1基因转录的干 扰分子。
[0025] 在另一优选例中，所述的干扰分子是以细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1的编码 基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或 形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以 SEQ ID NO: 1第47-542位作为沉默靶标的dsRNA或构建物。
[0026] 在另一优选例中，所述干扰分子含有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列（即SEQ ID NO:1 中第 47-542 位）。
[0027] 在另一优选例中，所述的干扰分子是构建物，含有式（I)所示的结构：
[0028] Seq 正向-X-Seq 反向 式（I)，
[0029] 式⑴中，SeqMS SEQ ID N0:4所示的多核苷酸，Seqg为与SeqM互补的多核 苷酸；
[0030] X为位于SeqM和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seq反向 不互补。
[0031] 在另一优选例中，所述降低植物中细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1表达的方法 包括：
[0032] (i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：
[0033] (a)含有反方向启动的细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1的编码基因或基因片段 (反义分子）的载体；
[0034] (b)含有可在植物体内形成特异性干扰细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1的编码 基因表达（或转录）的成分的干扰分子的载体；
[0035] (ii)将植物的组织或器官与步骤（i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物 组织或器官。
[0036] 较佳地，所述方法还包括：
[0037] (iii)选择出转入了所述载体的植物组织或器官；和
[0038] (iv)将步骤（iii)中的植物组织或器官再生成植物。
[0039] 在另一优选例中，所述调控植物（如作物）农艺性状和/或产量性状的方法包括： 提高植物中细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的表达，从而：
[0040] 增加植物侧根密度；
[0041] 抑制植物根系生长和不定根生成；
[0042] 降低植物株高；
[0043] 抑制植物茎叶生长或分蘖；
[0044] 加速植物的抽穗、开花、灌浆或衰老；
[0045] 降低植物的穗长、一级分枝、二级分枝或单穗籽粒数；
[0046] 降低植物种子的粒长、粒宽、粒厚或千粒重；和/或
[0047] 提高植物中cZOG的含量。
[0048] 在另一优选例中，所述提高植物中细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1的表达的方 法包括：将编码细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的多核苷酸转入植物，获得转化入所述多 核苷酸的植物。
[0049] 在另一优选例中，所述提高植物中细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1的表达的方 法包括：
[0050] (S1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码细胞分 裂素 _〇_匍糖糖基转移酶1 ;
[0051] (S2)将植物的细胞或组织或器官与步骤（S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多 核苷酸转入植物组织、器官或种子。
[0052] 在另一优选例中，所述提高植物中细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1的表达方法 还包括：
[0053] (S3)选择出转入了所述的多核苷酸的植物组织、器官或种子；和
[0054] (S4)将步骤（S3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。
[0055] 在本发明的另一方面，提供一种细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1或其编码基因 用途，用于调控植物（如作物）农艺性状或产量性状。
[0056] 在一个优选例中，所述的细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1选自下组：
[0057] (a)如SEQ ID N0:3氨基酸序列的多肽；
[0058] (b)将SEQ ID N0:3氨基酸序列经过一个或多个（如1-20个；较佳地1-10 ;更佳 地1-5个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的 多肽；或
[0059] (c)与（a)限定的多肽序列有80%(较佳地90% ;更佳地95% ;更佳地98%)以上同 源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽。
[0060] 在另一优选例中，所述的细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1的编码基因包含如下 序列：SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2或其简并序列。
[0061] 在本发明的另一方面，提供一种细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1或其编码基因 用途，用于作为鉴定植物（如作物）农艺性状或产量性状的分子标记；较佳地，所述的农艺 性状或产量性状包括：根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数、籽粒形态和 /或千粒重。
[0062] 在本发明的另一方面，提供一种降低细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1表达的物 质的用途，用于调控植物（如作物）农艺性状或产量性状；较佳地，用于：
[0063] 增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝和单穗籽粒数；
[0064] 提高植物种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重
[0065] 促进植物的分蘖能力；
[0066] 促进植物茎叶生长；
[0067] 增加植物株高；
[0068] 适度延迟植物灌浆期旗叶的衰老；
[0069] 促进植物根系发育和不定根生成；
[0070] 降低植物侧根密度；和/或
[0071] 降低植物中cZOG的含量。
[0072] 在一个优选例中，所述的降低细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1表达的物质是 特异性干扰细胞分裂素-〇-葡糖糖基转移酶1基因转录的干扰分子；较佳地，所述的干扰 分子是以细胞分裂素-〇-葡糖糖基转移酶1的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的 dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、 微小RNA的构建物；较佳地，所述的干扰分子是以SEQ ID NO: 1第47-542位作为沉默靶标 的dsRNA或构建物。
[0073] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0074] 图1、显示了水稻OsCOGIRNAi和过表达株系根的表型分析。（a-b) :0sC0GlRNAi和 过表达株系的qRT-PCR分析。实验中每个株系的RNA均来源于10个单株叶片的混合样品。 (c):水培2周的幼苗的侧根。（d):大田生长4周左右的转基因株系的侧根。（e-g):水培两 周幼苗的主根长，不定根数和侧根密度的统计。其中侧根密度的统计方式是选取侧根已完 全长出的距根基部2cm的范围内进行侧根数的统计。每个株系统计10个单株。Bar=lcm。
[0075] 图2、显示了水稻OsCOGl过表达和RNAi株系幼苗的表型观察与统计。（a):萌发2 周的野生型、RNAi及过表达转基因幼苗株高（Bar=5cm)。（b) :a图中幼苗株高的统计结果。 〇1=10，*奸>值〈0.01，51：11(16111:'8 1:七681:)。（(3):田间生长7周幼苗平均一级分蘖数统计结 果。〇1=10，**?值〈0.01，31：11(16111:'8 1:七681:)。（(1)田间生长7周幼苗，（1^『=10〇11)。
[0076] 图3、显示了水稻OsCOGl过表达和RNAi株系抽穗期的表型观察与统计。（a-b): 田间生长10周的RNAi (a)和过表达（b)株系。Bar=10cm(c):同期各株系主蘖穗。 Bar=10cm(d-e) :(c)图中各主蘖穗顶部小穗状态。RNAi株系正处于扬花期，过表达株系已 开始灌楽。Bar=2mm(f):田间生长10周的过表达和RNAi株系株系平均一级分蘖数统计结 果。（n=20，**P值〈0.01，Student' s t test) (g):田间生长10周的株系抽穗情况统计。 以每株植物的主蘖穗是否抽出为标准，" out "表示主蘖穗已完全抽出；"mid"表示主檗穗部 分抽出；"in"表示主蘖穗尚未抽出。每个株系统计50个单株再计算百分比。
[0077] 图4、显示了水稻OsCOGIRNAi和过表达株系生长末期的表型观察与统计。（a):生 长13周的株系的平均株高统计。〇1=20，*奸 >值〈0.01，31：11(16111:'8 1:七681:)(13):生长14周 的RNAi和过表达株系。（c):生长14周的过表达和RNAi株系的旗叶观察。Bar=10cm。
[0078] 图5、显示了水稻OsCOGIRNAi和过表达株系的主蘖穗性状统计。（a):各株系的主 蘖穗。Bar=5cm;(b):平均主蘖穗长。（c):主蘖穗平均一级分枝数。（d):主蘖穗平均二级 分枝数。（e):每穗谷粒数。（n=20,林P 值〈0.01，Student' s t test)。
[0079] 图6、显示了水稻OsCOGIRNAi和过表达株系的籽粒性状统计。（a)籽粒照片， Bar=2mm;(b):千粒重；(c):籽粒长宽比；⑷：平均粒长；（e):平均粒宽；（f):平均粒厚。 (n=20,林P 值〈0.01，Student，s t test)
[0080] 图7、显示了水稻OsCOGl的原位杂交分析。（a):正义探针杂交对照。（b-c):茎端 分生组织（SAM)。（d，g，i):不同发育时期的花序原基。（e):萌发4天的幼苗地上部分横 切。（f):侧芽。（h):不定根原基。（j-m)萌发4天水稻幼苗根部的原位杂交结果。OsCOGl 主要在侧根原基（k)，（1)以及根尖（m)中表达。（j)为正义探针对照。Bar=100um
[0081] 图8、显示了水稻OsCOGl的RNAi和过表达株系内源细胞分裂素糖苷物 cisZeatin-O-glucoside(cZOG)的含量测定结果。（a) :cZ0G在三个株系中的含量（n=3)。 (b) :cZ0G标准品与测试样品的色谱峰（HPLC)。（c) :cZ0G标准品与测试样品的一级质谱图 (MS)。（d) :cZ0G标准品与测试样品的二级质谱图（MS/MS)。
【具体实施方式】
[0082] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次分离到一种细胞分裂素-0-葡糖糖基转移 酶1 (￡YTOKININ-〇-￡LUCOSYLTRANSFERASEl ;C0G1)。通过在植物中定向调控其表达水平，可 显著改变植物（如作物）植株的根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数以及 籽粒形态和千粒重等重要的农艺性状和产量性状，进而达到改良植物株型和穗型结构，增 加产量等目的。
[0083] 如本文所用，所述的"植物"可以是各种农作物、花卉植物、或林业植物等，包括但 不限于：禾本科植物（如稻属）。例如，所述的"植物"包括但不限于：水稻、小麦、玉米、大 麦、大豆、油菜、棉花等。
[0084] 本发明还包括细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的片段、衍生物和类似物。如本 文所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的细胞分裂素-0-葡糖 糖基转移酶1相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以 是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多 肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多 个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形 成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白）。 根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0085] 任何一种细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的生物活性片段都可以应用到本发明 中。在这里，细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的生物活性片段的含义是指作为一种多肽， 其仍然能保持全长的细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的全部或部分功能。通常情况下， 所述的生物活性片段至少保持50%的全长细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的活性。在更 优选的条件下，所述活性片段能够保持全长细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的60%、70%、 80%、90%、95%、99%、或 100% 的活性。
[0086] 在本发明中，术语"细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1"指具有细胞分裂素-0-葡 糖糖基转移酶1活性的SEQ ID N0:3序列的多肽。该术语还包括具有与细胞分裂素-0-葡 糖糖基转移酶1相同功能的、SEQ ID N0:3序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限 于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如 1-8个、1-5个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一 个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在 本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包 括细胞分裂素-〇-葡糖糖基转移酶1的活性片段和活性衍生物。
[0087] 多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突 变体、在高或低的严紧度条件下能与细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1DNA杂交的DNA所编 码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含细胞分裂素-〇-葡糖糖基转移酶1或其片段 的融合蛋白。
[0088] 任何与所述的细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1同源性高（比如与SEQ ID N0:3 所示的序列的同源性为70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90% 或更高，如同源性95%，98%或99%)的、且具有细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1相同功能 的蛋白也包括在本发明内。
[0089] 在本发明中，"细胞分裂素 -0-葡糖糖基转移酶1保守性变异多肽"指与SEQ ID NO: 3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个 氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1 进行氨基酸替换而产生。
[0090] 表 1
[0091]
【权利要求】
1. 一种调控植物农艺性状和/或产量性状的方法，其特征在于，所述方法包括：调节植 物中细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1的表达。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物是禾本科植物；较佳地，所述的 禾本科植物是水稻，小麦、玉米、黑麦、高粱；和/或 所述的农艺性状或产量性状包括：根系发育、分蘖能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒 数、籽粒形态和/或千粒重。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1选 自下组： (a) 如SEQ ID N0:3氨基酸序列的多肽； (b) 将SEQ ID N0:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的，且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽；或 (c) 与（a)限定的多肽序列有80%以上同源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多 肽。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：降低植物中细胞分裂 素-〇-葡糖糖基转移酶1的表达；从而： 增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝和单穗籽粒数； 提高植物种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重 促进植物的分蘖能力； 促进植物茎叶生长； 增加植物株高； 适度延迟植物灌浆期旗叶的衰老； 促进植物根系发育和不定根生成； 降低植物侧根密度；和/或 降低植物中cZOG的含量。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述降低植物中细胞分裂素-0-葡糖糖基转 移酶1的表达包括： 将下调细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转 入植物中；较佳地，所述的下调剂是特异性干扰细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1基因转录 的干扰分子。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的干扰分子是以细胞分裂素-0-葡糖糖 基转移酶1的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小 RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物；较佳地，所述的 干扰分子是以SEQ ID NO: 1第47-542位作为沉默靶标的dsRNA或构建物。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：提高植物中细胞分裂 素-〇-葡糖糖基转移酶1的表达，从而： 增加植物侧根密度； 抑制植物根系生长和不定根生成； 降低植物株高； 抑制植物茎叶生长或分蘖； 加速植物的抽穗、开花、灌楽或衰老； 降低植物的穗长、一级分枝、二级分枝或单穗籽粒数； 降低植物的粒长、粒宽、粒厚或千粒重；和/或 提高植物中cZOG的含量。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：将编码细胞分裂素-0-葡糖糖基转移 酶1的多核苷酸转入植物，获得转化入所述多核苷酸的植物。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，包括： (51) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有多核苷酸，其编码细胞分裂 素_〇_匍糖糖基转移酶1 ; (52) 将植物的细胞或组织或器官与步骤（S1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷 酸转入植物组织、器官或种子。
10. -种细胞分裂素-〇-葡糖糖基转移酶1或其编码基因用途，用于调控植物农艺性状 或产量性状。
11. 如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1 选自下组： (a) 如SEQ ID N0:3氨基酸序列的多肽； (b) 将SEQ ID N0:3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的，且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多肽；或 (c) 与（a)限定的多肽序列有80%以上同源性且具有（a)多肽功能的由（a)衍生的多 肽。
12. -种细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1或其编码基因的用途，用于作为鉴定植物农 艺性状或产量性状的分子标记；较佳地，所述的农艺性状或产量性状包括：根系发育、分蘖 能力、抽穗时间、穗型结构、每穗籽粒数、籽粒形态和/或千粒重。
13. -种降低细胞分裂素-0-葡糖糖基转移酶1表达的物质的用途，用于调控植物农艺 性状或产量性状；较佳地，用于： 增加植物的穗长、一级分枝、二级分枝和单穗籽粒数； 提高植物种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重 促进植物的分蘖能力； 促进植物茎叶生长； 增加植物株高； 适度延迟植物灌浆期旗叶的衰老； 促进植物根系发育和不定根生成； 降低植物侧根密度；和/或 降低植物中cZOG的含量。
【文档编号】C12N15/113GK104250652SQ201310259575
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】郭房庆, 商晓玲, 田华 申请人:中国科学院上海生命科学研究院