轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法
【专利摘要】本发明公开了轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法，其中检测引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP，分别如SEQ?ID?NO.1、2、3和4所示。本发明的LAMP检测方法采用4条LAMP特异性引物及BstDNA聚合酶为等主要成分构成的LAMP反应液，建立的猪轮状病毒环介导等温扩增快速检测方法，可提高临床诊断的速度和准确性，且操作简单，成本低廉，适合基层使用，能有效诊断该病原引起的猪轮状病毒感染，该病得以控制后，将显著提高生猪出栏率、降低生猪死亡率，提高生猪产业的经济效益。
【专利说明】轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002]轮状病毒(Rotavirus)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae),轮状病毒属(Rotaviras)，是人畜共患重要病原之一，可感染多种动物。猪的轮状病毒(porcinerotavirus, RV)感染最常见于仔猪，1_4周龄仔猪发病率超过80%，死亡率7%_20%。患猪主要表现为严重腹泻，排水样粪便，呈黄色到白色，含不同程度的絮状物，部分病例因严重脱水、酸碱平衡失调、 继发感染而死亡。
[0003]目前轮状病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非特异性出现等缺陷。
[0004]近年来，一种新型核酸扩增技术一环介导等温扩增(LAMP)技术，由于其快速、简单、特异等特点，越来越多运用于疫病诊断。LAMP技术是T.Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术主要利用4种不同的特异性引物识别靶基因6个特定区域及一种具有链置换特性的DNA聚合酶在等温条件下进行高效、快速、高特异地扩增靶基因。该技术可用于微生物的快速检测，已广泛应用于食品、农业、卫生等领域。近年来，LAMP技术在动物疫病诊断方面发展迅速，已开发出猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒等LAMP检测方法，但目前尚未见有检测猪轮状病毒LAMP检测技术的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及基于该环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒，利用该检测试剂盒可以特异性的检测轮状病毒(rotavirus)。
[0006]本发明轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组，其由下列引物组成；
[0007]上游引物F3:5' -ACCATTCCTTAACGCACAA-3' (SEQ ID N0.1)；
[0008]下游引物B3:5' -GGCAACATCAGCATAGTCTT-3' (SEQ ID N0.2)；
[0009]上游内引物FIP:5'-
[0010]CAAGCACAAAGTCGAAGTTAGAAATAAATCTTCCAATTACTGGGTC-3' (SEQ ID N0.3)；
[0011]下游内引物BIP:5' -CTGAAGCTGCAACAGAAATAAACGATCCTGTTGGCCATCCT-3' (SEQID N0.4)。
[0012]本发明轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组是根据猪轮状病毒VP4基因中较为保守的六个序列片段设计的两个特异性内引物(上游引物和下游引物)和两个特异性外引物(上游内引物和下游内引物)，该保守基因序列为猪轮状病毒所共有的，以保证基于该轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒检测不同来源的猪轮状病毒的可靠性。
[0013]基于上述的轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒，其包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂和环介导等温扩增反应试剂和显色试剂，所述环介导等温扩增反应试剂包括环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶，所述环介导等温扩增反应液由以下的组分组成:10ymol/L的上游引物F3、10 μ mol/L的下游引物B3、10 μ mol/L的上游内引物FIP、10ymol/L 的下游内引物 BIP、5mol/L Betaine、100mmol/L MgSO4U.6mmol/L dNTPs、IOXThermo pol反应缓冲液。
[0014]所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤:
[0015]I)样品病毒RNA的提取；
[0016]2)将步骤I提取的病毒RNA逆转录成cDNA ；
[0017]3)先建立环介导等温扩增反应体系，然后在60-65°C等温条件下保温30_60min完成cDNA扩增反应；
[0018]其中，环介导等温扩增反应体系共25μ L,具体包括:10XBst Thermo polBuffer2.5 μ LUO μ mol/L 上游引物 F30.5 μ LUO μ mol/L 下游引物 B30.5 μ LUO μ mol/L 上游内引物 FIP4y L、10ymol/L 下游内引物 ΒΙΡ4μ L、l.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y L、100mmol/LMgS040.9 μ L、8U/y L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20 补充至 25 μ L ;
[0019]4)通过显色剂或琼脂糖凝胶电泳确认是否存在扩增产物。
[0020]本发明针对传统检测猪轮状病毒技术操作繁琐，需要昂贵仪器，敏感性差等问题，采用环介导等温扩增技术，建立检测猪轮状病毒的LAMP检测试剂盒及检测方法，该方法使用仪器简单、成本低、检测快速、特异性强，敏感度高，可肉眼判断结果，适于基层现场检测，从而可解决其临床上诊断困难的问题。本发明上述检测方法中，所述步骤I的具体操作为:
[0021]I)每50-IOOmgRNA样品用ImL Trizol液试剂对组织进行裂解；
[0022]2)将上述RNA样品的Trizol液转入EP管中，在15_30°C下放置5分钟；
[0023]3)在上述EP管中，按照每ImL Trizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15秒，在15°C-30°C下放置2-3分钟后，在2°C-8°C下以12000g的离心力离心15分钟；取上层水相置于另一根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇，在15°C-30°C下放置10分钟，然后在2°C-8°C下以12000g的离心力离心10分钟；弃上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，在2°C-8°C下以7500g的离心力离心5分钟，弃上清液；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；然后用Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。
[0024]所述步骤I提取的RNA样品0D26Q/0D28Q在1.7-2.0间，浓度为IO-1OOg/ μ L。
[0025]本发明上述检测方法中，所述步骤2的具体操作为:在1.5mL离心管中配制如下反应液:将RNA溶液10 μ L、随机弓丨物I μ L、DEPC水I μ L离心混匀；然后在_70°C孵育5min，立即置(TC冷却，接着在离心管中加入5XM-MLV buffer4y L、RNA酶抑制I μ L、dNTP mixtureI μ L、M-MLV反转录晦I μ L、DEPC水5 μ L，将上述反应液置42°C温育60min，反转录完成后，95灭活M-MLV，即得cDNA产物。
[0026]本发明采用4条LAMP特异性引物及Bst DNA聚合酶为等主要成分构成的LAMP反应液，采用环介导等温扩增技术，建立检测猪轮状病毒的LAMP检测试剂盒及检测方法。因环介导等温扩增技术具有敏感、特异、快速、可靠、简便的特点，使得它与其它诊断技术相t匕，更适合于临床实验室诊断。本发明建立的猪轮状病毒环介导等温扩增快速检测方法，可提高临床诊断的速度和准确性，且操作简单，成本低廉，适合基层使用，能有效诊断该病原引起的猪轮状病毒感染，该病得以控制后，将显著提高生猪出栏率、降低生猪死亡率，提高生猪产业的经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0028]图1为实施例3敏感性实验的检验电泳图；
[0029]图2为实施例特异性实验的检验电泳图。 【具体实施方式】
[0030]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0031]本发明本发明轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组，其由下列引物组成；
[0032]上游引物F3:5' -ACCATTCCTTAACGCACAA-3'；
[0033]下游引物B3:5' -GGCAACATCAGCATAGTCTT-3'；
[0034]上游内引物FIP:5'-
[0035]CAAGCACAAAGTCGAAGTTAGAAATAAATCTTCCAATTACTGGGTC-3'；
[0036]下游内引物BIP:5' -CTGAAGCTGCAACAGAAATAAACGATCCTGTTGGCCATCCT-3'。
[0037]基于上述的轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒，其包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂和环介导等温扩增反应试剂和显色试剂，所述环介导等温扩增反应试剂包括环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶，所述环介导等温扩增反应液由以下的组分组成:10 μ mol/L的上游引物F3 (SEQ ID N0.1)、10 μ mol/L的下游引物B3 (SEQ IDN0.2)、10ymol/L 的上游内引物 FIP(SEQ ID N0.3)、10 μ mol/L 的下游内引物 BIP(SEQ IDN0.4)、5mol/L Betaine、100mmol/L MgS04、1.6mmol/L dNTPs> 10X Thermo pol 反应缓冲液。
[0038]所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的检测方法，其包括以下步骤:
[0039]I)样品病毒RNA的提取；
[0040]2)将步骤I提取的病毒RNA逆转录成cDNA ；
[0041]3)先建立环介导等温扩增反应体系，然后在60-65°C等温条件下保温30_60min完成cDNA扩增反应；
[0042]其中，环介导等温扩增反应体系共25μ L,具体包括:10XBst Thermo polBuffer2.5 μ LUO μ mol/L 上游引物 F30.5 μ LUO μ mol/L 下游引物 B30.5 μ LUO μ mol/L 上游内引物 FIP4y L、10ymol/L 下游内引物 ΒΙΡ4μ L、l.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y L、100mmol/LMgS040.9 μ L、8U/y L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20 补充至 25 μ L ;
[0043]4)通过显色剂或琼脂糖凝胶电泳确认是否存在扩增产物。
[0044]具体实施例1对某一例疑似RV感染样品进行LAMP检测
[0045](I)样品RNA的提取；
[0046]I)组织样品，每50-IOOmgRNA样品用ImL Trizol液试剂对组织进行裂解；
[0047]2)将上述RNA样品的Trizol液转入EP管中，在15_30°C下放置5分钟；
[0048]3)在上述EP管中，按照每ImL Trizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15秒，在15°C-30°C下放置2-3分钟后，在2°C-8°C下以12000g的离心力离心15分钟；取上层水相置于另一根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇，在15°C-30°C下放置10分钟，然后在2°C-8°C下以12000g的离心力离心10分钟；弃上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，在2°C-8°C下以7500g的离心力离心5分钟，弃上清液；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；然后再用Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。
[0049](2 )将步骤I提取的病毒RNA逆转录成cDNA ；
[0050]在1.5mL离心管中配制如下反应液:将RNA溶液10 μ L、随机引物I μ L、DEPC水I μ L离心混匀；然后在_70°C孵育5min，立即置0°C冷却，接着在离心管中加入5XM-MLVbuffer4y L.RNA 酶抑制 I μ L、dNTP mixture I μ L、M_MLV 反转录晦 I μ L、DEPC 水 5μ L，将上述反应液置42°C温育60min，反转录完成后，95灭活M-MLV，即得cDNA产物。
[0051](3)先建立环介导等温扩增反应体系，然后在60-65°C等温条件下保温30_60min完成cDNA扩增反应；其中，环介导等温扩增反应体系共25 μ L，具体包括:10XBst Thermopol Buffer2.5μ L、10ymol/L 上游弓丨物 F30.5 μ L、10 μ mol/L 下游弓丨物 B30.5 μ L、10 μ mol/L 上游内引物 FIP4 μ LUOy mol/L 下游内引物 BIP4 μ L、1.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y LUOOmmol/L MgSO40.9 μ L、8U/μ L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20补充至25yL；
[0052](4)通过显色剂确认是否存在扩增产物。
[0053]在待检的每个反应管中加入I μ L SYBR Green I染料，肉眼观察颜色变化，若阳性对照呈绿色，阴性对照呈橙色，说明反应有效。若被检测样品反应液颜色变为绿色，说明待检样品为含有猪轮状病毒。
[0054]其结果为:阴极对照(模板为猪流行性腹泻病毒核酸)黄色，不含有猪轮状病毒，2号样品为本实施例的疑似RV感染样品，其颜色为绿色，含有猪轮状病毒。
[0055]具体实施例2对另一例疑似RV感染样品进行LAMP检测
[0056](I)样品RNA的提取；
[0057]I)每50-IOOmgRNA样品用ImL Trizol液试剂对组织进行裂解；
[0058]2)将上述RNA样品的Trizol液转入EP管中，在15_30°C下放置5分钟；
[0059]3)在上述EP管中，按照每ImL Trizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用力震荡15秒，在15°C-30°C下放置2-3分钟后，在2°C-8°C下以12000g的离心力离心15分钟；取上层水相置于另一根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇，在15°C-30°C下放置10分钟，然后在2°C-8°C下以12000g的离心力离心10分钟；弃上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，在2°C-8°C下以7500g的离心力离心5分钟，弃上清液；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。
[0060](2)将步骤I提取的病毒RNA逆转录成cDNA ；
[0061]在1.5mL离心管中配制如下反应液:将RNA溶液10 μ L、随机引物I μ L、DEPC水I μ L离心混匀；然后在_70°C孵育5min，立即置0°C冷却，接着在离心管中加入5XM-MLVbuffer4y L.RNA 酶抑制 I μ L、dNTP mixture I μ L、M_MLV 反转录晦 I μ L、DEPC 水 5μ L，将上述反应液置42°C温育60min，反转录完成后，95灭活M-MLV，即得cDNA产物。
[0062](3)先建立环介导等温扩增反应体系，然后在60-65°C等温条件下保温30_60min完成cDNA扩增反应；其中，环介导等温扩增反应体系共25 μ L，具体包括:10XBst Thermopol Buffer2.5μ L、10ymol/L 上游弓丨物 F30.5 μ L、10 μ mol/L 下游弓丨物 B30.5 μ L、10 μ mol/L 上游内引物 FIP4 μ LUOy mol/L 下游内引物 BIP4 μ L、1.6mmol/L dNTPs2 μ L、5mol/L Betaine5y LUOOmmol/L MgSO40.9 μ L、8U/μ L Bst DNA 聚合酶 I μ L、cDNAl μ L，其余由ddH20补充至25yL；
[0063](4)通过琼脂糖凝胶电泳确认是否存在扩增产物。
[0064]待LAMP反应结束后，取I μ L反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，阳性对照呈阶梯状特异扩增，而阴性对照无扩增说明反应有效，在此基础上，若待检测样品呈阶梯状特异扩增则为RV阳性，若无扩增则为RV阴性。
[0065]其结果为:阴极对照(模板为猪流行性腹泻病毒核酸)无阶梯状特异扩增，不含有猪轮状病毒，2号样品为本实施例的疑似RV感染样品，其呈阶梯状特异扩增，含有猪轮状病毒。
[0066]实施例3敏感 性试验:
[0067]将实施例2样品的RNA从10°-10_7进行10倍梯度稀释，然后按照实施例2中的步骤2到4的方法进行反转录、环介导等温扩增和扩增产物的检验，验证本发明的灵敏度。如图1所示，采用琼脂糖凝胶电泳进行检验发现，1-5泳道分别为10_3，10_4，10_5，10_6，10_7稀释度的cDNA模板，其中，10_3，10_4，10_5，10_6稀释度的cDNA模板都呈阶梯状特异扩增。试验结果表明，本发明LAMP法检测灵敏度可达到ΙΟ—6稀释度(含量为IOpg)。
[0068]实施例4特异性试验
[0069]将猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒及实施例2确定含有猪轮状病毒阳性的样品，按照实施例2步骤2到4的LAMP法再次检测。检测结果如图2所示，1-3泳道分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒，无阶梯状特异扩增，为阴性；这三种已知阴性的样品，在LAMP检测结果中仍然呈现阴性；4泳道为猪轮状病毒，呈阶梯状特异扩增，该样品在LAMP检测结果中仍然呈现阳性。表明LAMP检测结果和PCR检测结果相吻合，验证了本发明所建立方法和试剂盒的特异性。
[0070]序列表
[0071]〈110〉龙岩学院生命科学学院
[0072]〈120〉轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒和检测方法
[0073]<160>4
[0074]<210>1
[0075]<211>19
【权利要求】
1.轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于:其由下列引物组成； 上游引物 F3:5' -ACCATTCCTTAACGCACAA-3'； 下游引物 B3:5' -GGCAACATCAGCATAGTCTT-3'； 上游内引物FIP:5'-
CAAGCACAAAGTCGAAGTTAGAAATAAATCTTCCAATTACTGGGTC-3'； 下游内引物 BIP:5' -CTGAAGCTGCAACAGAAATAAACGATCCTGTTGGCCATCCT-3'。
2.基于权利要求1所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒，其特征在于:其包括RNA提取试剂、RNA逆转录试剂和环介导等温扩增反应试剂和显色试剂，所述环介导等温扩增反应试剂包括环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶，所述环介导等温扩增反应液由以下的组分组成:10iimol/L的上游引物F3、10iimol/L的下游引物B3、10 u mol/L 的上游内引物 FIPUO u mol/L 的下游内引物 BIP、5mol/L BetaineUOOmmol/LMgS04、1.6mmol/L dNTPs、10XThermo pol 反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于:其包括以下步骤: 1)样品病韋RNA的提取； 2)将步骤I提取的病毒RNA逆转录成cDNA； 3)先建立环介导等温扩增反应体系，然后在60-65°C等温条件下保温30-60min完成cDNA扩增反应； 其中，环介导等温扩增反应体系共25 ii L,具体包括:10 X Bst Thermo polBuffer2.5 ii L、10ii mol/L 上游引物 F30.5 u LUO u mol/L 下游引物 B30.5 u LUO u mol/L 上游内引物 FIP4ii L、10ii mol/L 下游内引物 BIP4y L、l.6mmol/L dNTPs2 y L、5mol/L Betaine5ii L、100mmol/LMgS040.9 L、8U/ii L Bst DNA 聚合酶 I y L、cDNAl y L，其余由ddH20 补充至 25 ii L ; 4)通过显色剂或琼脂糖凝胶电泳确认是否存在扩增产物。
4.根据权利要求3所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于:所述步骤I的具体操作为: 1)每50-IOOmgRNA样品用ImLTrizol液试剂对组织进行裂解； 2)将上述RNA样品的Trizol液转入EP管中，在15_30°C下放置5分钟； 3)在上述EP管中，按照每ImLTrizol液加0.2mL氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，用カ震荡15秒，在15°C-30°C下放置2-3分钟后，在2°C-8°C下以12000g的离心カ离心15分钟；取上层水相置于另ー根EP管中，按照每ImL Trizol液加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇，在15°C-30°C下放置10分钟，然后在2°C-8°C下以12000g的离心カ离心10分钟；弃上清液，按照每ImL Trizol液加lmL75%こ醇进行洗涤，涡旋混合，在2°C-8°C下以7500g的离心カ离心5分钟，弃上清液；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；然后用Rnase-free water 溶解 RNA 沉淀。
5.根据权利要求4所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于:所述步骤I提取的RNA样品0D26Q/0D28Q在1.7-2.0间，浓度为IO-1OOg/yし
6.根据权利要求3所述的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒的检测方法，其特征在于:所述步骤2的具体操作为:在1.5mL离心管中配制如下反应液:将RNA溶液10yL、随机引物I μ L、DEPC水I μ L离心混匀；然后在_70°C孵育5min，立即置0°C冷却，接着在离心管中加入5XM-MLVbuffer4y L、RNA 酶抑制 lyL、dNTP mixture I μ L、M-MLV 反转录晦 I μ L、DEPC 水 5 μ L，将上述反应液置 42°C温育60min，反转录完成后，95灭活M-MLV，即得cDNA产物。
【文档编号】C12Q1/70GK103451315SQ201310258549
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】郑新添, 杨小燕, 黄翠琴 申请人:龙岩学院