专利名称：：一种利用基因转化改善水稻产量性状的方法
技术领域：
：本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种利用lrkl基因转化提高水稻产量和改善产量性状的方法。
背景技术：
：目前国内外利用转基因改良作物经济性状的技术与方法主要是根据已知的功能基因与表型性状的关系，采用组成型表达载体或组织专一性表达载体将目的基因导入目标植物，以期获得作物特定经济性状或抗逆性性状的改良.在农作物特别是谷类作物中，产量性状通常是由多基因或称数量基因控制的。分离与克隆这类产量性状基因的方法一般采用定位克隆技术，然后通过转基因验证其功能。以栽培水稻与江西东乡野生稻杂交与回交构建的基因系为材料，通过染色体定位与基因组序列分析分离克隆了来自东乡野生稻基因组的一组编码跨膜受体蛋白LRK的基因，共有8个首尾相连簇集排列的家族成员，分别命名为lrkl，lrk2，lrk3，lrk4，lrk5，lrk6，lrk7和lrk8。在有些籼稻品种中只含有7个lrk基因，它们缺少lrkl基因。粳稻中，lrk2，lrk3和lrk5基因不表达。籼稻中，缺少lrkl基因，lrk3和lrk5基因不表达(GuangmingHe，XiaojinLuo，FengTian，KeguiLi，ZuofengZhu，WeiSu，XiaoyinQian，Xiangk皿Wang，ChuangqingS皿andJinshuiYang氺H即lotypeVariationinStructureandExpressionofaGeneClusterthatisAssociatedwithaQuantitativeTraitLocusforImprovedYieldinRice，GenomeResearch,2006，16:618-626)。这个基因簇位于水稻2号染色体的端部，其DNA序列已经登录在国际基因组数据库NCBI，克隆编号为AY756174和DQ195081。经水稻苗期分子检测证实，在粳稻日本晴的8个lrk基因中，有5个基因表达，分别为lrkl，lrk4，lrk6，lrk7和lrk8。在籼稻9311(超级杂交稻亲本之一)中，也有5个lrk基因表达，分别为lrk2，lrk4，lrk6，lrk7和lrk8。但是，尚未有利用这组lrk基因提高水稻产量或者明显改善产量性状的报道。
发明内容本发明目的是提供一种利用基因转化提高水稻产量的方法。本发明提供了一种提高水稻产量的方法，即用水稻lrkl基因转化水稻，所述的lrkl基因的蛋白氨基酸序列如SEQIDNO2所示。本发明中，水稻lrkl基因是指氨基酸序列如SEQIDNO2的蛋白。该术语还包括具有与水稻lrkl蛋白相同功能的、SEQIDN0.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻lrkl蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明中，所述的lrkl基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。本发明中，水稻lrkl基因的核苷酸序列包括编码具有水稻lrkl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.l中32-3181位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.l序列的编码框32-3181位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.l中32-3181位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQIDNO.1中从核苷酸32-3181位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQIDNO.1中从核苷酸32-3181位的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本发明中，所述的方法具体包括以下步骤(1)将lrkl基因编码序列插入植物表达载体构建重组表达载体；(2)诱导处理水稻愈伤组织；(3)用(1)所得的重组表达载体转化水稻愈伤组织；(4)恢复培养(3)所得的水稻愈伤组织。本发明中，所述的植物表达载体可以是常规的水稻表达载体。构建重组序列的方法参考《分子克隆》的标准方法，例如，将lrkl基因编码序列克隆到植物表达载体的多克隆位点。本发明中，所述的植物表达载体可以是已经市售或者文献报道过的植物表达载体，例如pCAMBIA1304等。本发明中，步骤(3)中用基因枪微弹轰击法实现重组表达载体转化水稻愈伤组织。除此以外，还可以参用其他常规的基因转化方法。本发明中，恢复培养水稻愈伤组织是先在不含筛选剂的诱导培养基上生长，然后再在含有筛选剂的培养基上筛选，并将筛选后的愈伤组织光照培养。本发明中，所述的筛选剂是潮霉素。在进行筛选时，可以采用筛选剂浓度逐步提高的方法，也可以配合光照条件进行。例如在本发明的一个实施例中，采用下述含有30mg/和50mg/L潮霉素的筛选培养基、同时配合暗培养约两周进行筛选。筛选完成后，所得即含有lrkl基因的愈伤组织，可以将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养，待分化出小植株后，再转入生根壮苗培养基，长大后移入温室。本发明提供了一种利用lrkl基因转化提高水稻产量及产量性状的方法。本发明利用基因枪微弹轰击法，将水稻lrkl基因转化水稻愈伤组织，经过恢复培养获得表达lrkl基因的水稻植株。结果显示，成功转化的水稻，其种子发芽势快于对照，苗期分蘖势好于对照，苗期生长势、苗期生长势和植株成熟穗子指标总体优于对照。本发明为水稻提高产量提供了一种低成本、高效益的新方法。图1是含lrkl基因的表达载体结构图。lrkl基因插入表达载体的位置有箭头标4不。图2是转lrkl基因的种子发芽势快于对照9311的结果图1。图3是转lrkl基因的种子发芽势快于对照9311结果图2。具体方法为浸种两天，催芽两天，催苗4天。图4是lrkl转基因苗期分蘖势好于对照9311结果图1。图5是lrkl转基因苗期生长势图。左，9311对照；右转lrkl基因9311。图6是lrkl转基因9311成熟单株图。左，9311对照，株高110厘米，分蘖数为9;右，lrkl转基因9311单株，株高105厘米，分蘖数为12。图7是lrkl转基因9311植株成熟穗子图。上，9311对照，穗长29.5厘米，第一枝梗为12，第二枝梗为54，总颖花数为244，千粒重为28克，生育期5/1播种，始穗8/7，采收9/5;下，lrkl转基因9311，穗长29.0厘米，第一枝梗为13，第二枝梗为73，总颖花数为293，千粒重为26克，生育期5/1播种，始穗8/2，采收9/5。具体实施例方式实施例llrkl基因的功能验证1)lrkl基因表达载体的构建采用pCAMBIA1304为表达载体，将东乡野生稻lrkl基因插入到pCAMBIA1304载体35S组型启动子下游。含lrkl基因的表达载体结构图如下2)lrkl基因转化实验与结果采用目前国内超级杂交稻的主要亲本之一9311为转基因受体。将9311成熟种子去壳消毒后接种在脱分化植物组织培育基上诱导愈伤组织。在愈伤组织诱导2-3周后，采用基因枪微弹轰击法，将含lrkl基因的纯化的pCAMBIA1304质粒DNA导入9311愈伤组织细胞。在添加30ppm潮霉素的MS培养基上连续培养3-4周筛选抗性细胞系，然后将筛选的细胞系转移到分化培养基诱导长芽和生根。3)转化处理试管苗移载及转化植株后代的分子检测将lrkl基因转化处理的9311试管苗移载田间，并在分蘖期取叶片提取DNA采用PCR扩放技术进行分子检测，于2005年秋获得阳性TO代。2005年冬，在海南岛加代繁殖，获得转基因Tl代，共计7个株系。4)lrkl转基因T2代群体产量性状的调查与统计将lrkl基因转基因T2代于2006年春播种，四叶期将转化的7个lrkl转基因T2代株系种植在复旦大学试验田。7个株系每个株系各种植49株，行株距为6寸X6寸，重复三次，同时设立9311亲本对照。在分蘖盛期调查统计分蘖数，成熟期统计有效穗数，单株总粒数和千粒重，结果如下株系号码平均株高(cm)主穗平均有效穗平均最长剑叶平均最长穗长平均每株总粒数平均每穗粒数千粒重株系195.966.6531.1222.421392210265<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>根据上述田间调查及考种数据，与对照相比，lrkl转基因9311的产量性状优于对有效穗增加27.8%;每株总粒数增加38.9%;平均每穗穗粒数增加8.9%。千粒重减少7%。水稻lrkl转基因增加产量的主要原因是增加分蘖力和有效穗以及穗粒数.转基因9311植株的平均穗长与对照基本一致，但穗粒数增加，主要是因为转基因株系的稻穗二次枝梗数增加，从而增加了每穗总粒数。实施例2水稻lrkl基因转化籼稻9311的方法1)选择lrkl全长0RF区段(见序列表)，采用PCR方法从东乡野生稻中将其扩增，并合成插入接头克隆到植物表达载体pCAMBIA1304，获得lrkl表达载体pCAMBIA1304/lrkl.2)诱导水稻愈伤组织培养基1.诱导及继代培养基MS+2mg/L2，4_D.2.高渗培养基MS+2mg/L2，4_D+46.67g/L山梨醇+46.67g/L甘露醇.3.第一轮筛选培养基MS+2mg/L2，4_D+30mg/L潮霉素.4.第二轮筛选培养基MS+2mg/L2，4_D+50mg/L潮霉素.5.分化培养基MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+50mg/L潮霉素.6.生根壮苗培养基l/2MS+0.lmg/LNAA注1.以上培养基均含30g/L蔗糖+2.5g/Lagar，pH5.82.愈伤诱导、继代、筛选培养条件为26-2『C暗培养，分化、生根壮苗为26-2『C及16小时光周期3)愈伤组织诱导与处理1.取授粉后12-15天的未成熟种子，在无菌条件下，先用70%乙醇浸洗10min，转入0.1%升汞浸泡20min，无菌水清洗3次。2.在无菌条件下剥离幼胚，接种于愈伤诱导培养基上，26-28t:暗培养约20天后切芽，继代一次。3.在继代培养基中挑选生长旺盛、淡黄色的愈伤约30-50块(每块3mm左右)，置于高渗培养基上中央，排成直径约2.5cm的圆圈内，培养约4-5h后用于转化。4)基因枪转化1.基因枪从宁波新芝科技有限公司购置的高压气体基因枪，型号GJ-IOOO.2.微粒子弹制备3.称取60mg鸨粉(直径约lum)，加入到1.5ml灭菌离心管中，再加入lml无水乙醇，振荡lmin，于10000rpm离心10s，弃上清，重复洗一次后，将金粉悬浮于lml无菌水中现用或-2(TC保存。4.吸取50ul鸨粉悬浮液于1.5ml离心管，依次加入5ugDNA、50u12.5MCaCl2、20ul0.1M亚精胺，振荡5分钟，10000rpm离心20s，弃上清，以140ul无水乙醇漂洗两次，加入60ul无水乙醇，悬浮待用。5)轰击受体材料1.将基因枪放于超净工作台上，用70%酒精擦净真空室，并将可裂膜、载粒膜、金属挡网(均由宁波新芝科技有限公司供货)于70%酒精中消毒30分钟，然后用无菌滤纸吸干或吹净残余酒精.2.打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀。3.将可裂膜装入固定、旋紧。4.取10ul包被DNA的钨粉无水乙醇悬浮液，均匀涂布于载粒膜中心，放在超净台上吹干。5.将载有微弹的载粒膜及挡网装入微弹发射装置，使有颗粒的一面朝下。6.将培养皿放在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央。7.打开气瓶，调节压力1100Psi。8.抽真空，当真空度达到需要值时，将VAC键转到Hold位置。9.轰击，每皿轰击2次(第一次轰击后将培养皿旋转90度后进行第二次轰击)，按放气键使真空表读数回零，取出样品，轰击后于高渗培养基上继续培养12-16h。6)转化愈伤组织筛选1.将打枪后高渗培养基上的愈伤转入不含筛选剂的诱导培养基上恢复生长5-7天。2.将愈伤转到含30mg/L潮霉素的筛选培养基上，均匀摆放，暗培养14-17天进行第一次抗性筛选。3.将抗性愈伤转入含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，暗培养8_12天进行第二次抗性筛选。7)水稻rFCA基因RRM2结构域转化植株筛选与检测1.转化试管苗分子检测A，将筛选后存活的愈伤于分化培养基上光照培养30天。B，待分化出小植株后，将小植株转入生根壮苗培养基，长大后移入温室。2.转化植株的分子检测分别采用PCR扩增和基因组Southern杂交杂法检测后选的转化植株，共获得两株含有转化的rFCA-RRM片段的阳性植株序列表〈210>1〈211>3240〈212>DNA〈213>0ryzasativa〈220〉〈221>CDS〈222>(32).(3181)〈223〉〈400>1ccaacttccatgctagtatcaccagaaaaccatgcagccacctcatttttea52MetGinProProHisPhe15tac朋gc朋age朋c3gactgcccatecctgttcttagecttgec100TyrLysThrGinSerAsnArgLeuProlieProValLeuSerLeuAla101520cttgtgctgctgetc朋cttc3CCtctccc3CCElgtteatgtgag148LeuValLeuLeuLeuAsnPheThrSerProThrSerSerCysThrGlu253035CElggag朋g朋ctecetcetc朋tttcetc3CCgggctttct朋ggat196GinGluLysAsnSerLeuLeuAsnPheLeuThrGlyLeuSerLysAsp40455055ggcetcageEltgteatgg朋ggatggcgtggattgttgcgagtgg244GlyGlyLeuSerMetSerTrpLysAspGlyValAspCysCysGluTrp606570g朋gggate3CCtgc3gagat￡igg3CCgtgactgatgtttea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