Anxa10基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于绵羊分子标记制备技术领域，具体设及一种ANXA10基因作为绵羊免 疫性状相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记克隆自ANXA10基因。
【背景技术】
[0002] 在养羊业生产中，疾病严重威胁着羊只的健康并造成巨大的经济损失。尽管通过 加强饲养管理和应用药物疫苗等措施可预防疾病，但未能十分有效控制传染病的流行，同 时大量药物的使用会使动物机体产生耐药性，给畜产品的安全造成隐患。
[0003] 长远来看，从抗病力的遗传基础研究出发，筛选抗性基因，从分子水平开展抗病育 种，从遗传上提高羊只对病原的抗性，增强免疫力是从根本上解决运一问题的重要途径。抗 病育种潜在的巨大经济效益W及某些疾病可作为研究人类疾病动物模型的诱人前景，正有 力地推动着运项工作的发展。随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展，抗病育 种在绵羊的育种中已经开始发挥重要作用。
[0004] 在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。目前国内外已鉴定出的主要抗病候选基 因有W下几个：
[0005] (1)天然抗性巨隧结合蛋白 1 (化 1:uralresistance-associatedmacrophage protein1，化ampl)，化amp是一个基因家族，是目前研究较多的宿主抗性基因之一，至少包 括2~3个成员，现已发现有化ampl和化amp2。国内外学者对化ampl基因与抗病力的相 关性进行了大量的研究，把化ampl基因作为功能基因研究其结构与动物抗病性状的报道 也较多，但主要集中在人类、小鼠、猪和家禽上（陈冬金，谢喜平，陈岩锋，等.畜禽Nrampl 基因抗病作用的研究进展.畜牧与饲料科学，2012, 33(7) : 79 - 81.)。绵羊的化ampl基 因定位在 1 号染色体 2q41 -q42 的区域（PitelF.E.P.Cribiu，M. "'ierle,etal.Regional localizationoftheovineNRAMPgenetochromosome2q41 -q42byinsitu hybridization.切togenetCellGenet，1995,70(l-2) :116 ~118.)，山羊的化ampl基因 定位于 2 号常染色体上长臂ql2. 2(VaccaG.Μ.Μ.化zzola，C.Pisano,etal.Qiromosomal localisationandgeneticvariationoftheSLCllAlgeneingoats(Caprahircus). VetJ，2011. 190(1) :60~65.)。研究发现，绵羊化ampl基因多态性与伤寒沙口氏菌易感 性和抗性有关（姚菊霞，王光华，马利青.羊主要抗病候选基因的研究进展.青海畜牧兽医 杂志，2014, 44巧）：40~43.)。化ampl蛋白可抵抗分枝杆菌、沙口氏菌等多种胞内寄生病 原菌的侵染而发挥重要的免疫功能，对畜禽机体抗病力影响较大（吴宏梅等，NRAMP1基因 研究进展及其在抗病育种中的应用.中国畜牧兽医，2005,32(4) :26~28.)。
[0006] (2)主要组织相容性复合物（MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成的一个定位于 动物某对染色体的特定区域，与免疫应答和抗病性密切相关的多基因家族，在宿主的免疫 反应中对病毒、细菌、寄生虫的控制和清除有重要作用。目前，已证实主要组织相容性复合 物与人类和家畜的多种疾病存在着密切关系。因此，近年来对MHC的研究成为家畜抗病育 种研究中的前沿部分（孙东晓，张況.反当家畜主组织相容性复合物的研究进展.中国畜 牧杂志，2002,38巧）：46~47.)。绵羊的MHC称为OLA(绵羊白细胞抗原），位于第20号染 色体上，具有高度的多态性和连锁不平衡性。根据MHC抗原结构和功能的不同，可将MHC分 为classI型classII型和classIII型D-般认为绵羊MHCclassII的多态性和遗传性是 为了保护机体组织对抗疾病的感染。在这个基因区域有DQ和DR两个亚区，0LAII类分子 的DQ和DR亚区的DRB和DQB两个基因位点所编码的MHC在抗原免疫系统中发挥着最主要 的作用；其第2个外显子编码抗原的功能区（抗原结合区）具有丰富的多态性，它组成II类 抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC与生产性能具有密切的联系，但需要进一步研究才 能应用于家畜的遗传标记。
[0007] 此外，其它有研究的与抗病力有关的基因是化R(Toll-likereceptor,Toll 样受体）MX1(Myxovirus(influenza)resistance1，粘液病毒（流感）抗性因子]_)、 IL1(Interleukins1，白?田胞介素 1)、PPA民G(Peroxisomeproliferatoractivated receptorgamma,过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因D
[0008] 膜联蛋白（Annexins，ANX)是一类钩依耐性，能够结合带负电荷膜麟脂的蛋白超 家族，与20世纪70年代末发现广泛存在真核细胞中，分为A、B、C、D、E、组，其中A组对应 脊椎动物中的ANX，有 13 个成员，gPANXl-13 巧rasadNB，BiankinAV，化kushima化et al.Geneexpressionprofilesinpancreaticintraepithelialneoplasiareflect theeffectsofHedgehogsignalingonpancreaticductalepithelialcells.Cancer Res, 2005, 65 巧）：1619-26.vanBaalJW,MilanoF，RygielAM,etal.Acomparative analysisbySAGEofgeneexpressionprofilesofBarrett'sesophagus,normal squamousesophagus,andgastriccardia.Gastroenterology, 2005, 129(4):1274 - 81. YehSH,ChenPJ,LaiMY,etal.Alleliclossonchromosomes4qand16pin Hepatocellularcarcinoma:associationwithelevatedalpha-fetoprotein production.Gastroenterology1996, 110:184 - 192·)。目前已有研究发现膜联蛋白超家 族各成员与肿瘤的发生发展有着紧密的联系。相关研究发现在乳腺癌和肝细胞癌中ANXA1 过度表达（BandoK,NagaiΗ,MatsumotoS,etal.Identificationofa1-cMregionof commondeletionon4q3assciatedwithprogressionofhepatocellularcarcinama. GenesChromosomCancer1999,25:284 - 289.WongN,LaiP,LeeSW,etal.Assessment ofgeneticchangesinhepatocellularcarcinomadetectedbycomparative genomichybrizationshiptodiseasestage,tumorsize,andcirrhosis.AmJPathol 1999,154:37 - 43·)，在大脑神经胶质瘤和膜腺癌中ANXA2高表达巧engSY，0uYH，Chen WJ,etal.AberrantexpressionsofannexinAlOshortisoform，osteopontinand alpha-fetoproteinatchromosome4qcooperativelycontributetoprogressionand poorprognosisofhepatocellularcarcinoma.IntJOncol2005,26(4) :1053 -61.)、在 急性早幼粒细胞性白血病中ANXA8高表达（彭小东，肖恭卫，刘小辉，等.膜联蛋白AlO与 基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子VEGF在人肝癌组织中表达的相关性及与临床病理 特征的关系.中华实验外科杂志，2010,27(12) :1844 - 1846.)，ANXA1的过度表达与乳腺癌 的潜在转移性呈正相关（XlUXiao-hui，PENGXiao-dong.EffectsofOver-e邱ression ofANXAlOGeneonProliferationandApoptosisofHepatocellularCarcinomaCell 1^;!_打6!1邱62.]"化过乙11〇11容1]11；!_￥8(3；!_16(31111〇1.2012,32巧）：669 -674.)，并且促进裸赢皮下移 植瘤瘤体生长化su肥,JengYM,MaoTLetal.化teninmu1:ationsareassociatedwith asubsetoflowstagehepatocellularcarcinomanegativeforhepatitisBvirus andwithfavor油lepro即osis.AmJPathol2000, 157:763 - 770.)。膜联蛋白AlO基 因（ANXAIO)是膜联蛋白（annexins)家族的新成员，定位于4号染色体长臂33区，其功能 尚不明确（陈红，曹丽华，王述森，等.遗传性弥漫性胃癌相关基因表达及突变分析.解剖 科学进展，2010, 16(3) : 193 - 196.)。Liu等应用RT-PCR检测原发性肝癌患者癌组织的 ANXAlOmRNA表达，在成人肝和肝细胞癌中有表达，在多个成人、胎儿组织、胆管细胞癌和其 他肿瘤中不表达，在182例单病灶的原发性肝癌患者中有121例癌组织中ANXAlOmRNA表 达急剧下调，并且运种下调与P53基因突变、早期肝内肿瘤复发W及低的4年生存率有关， ANXA10在大肝癌中表达下调的幅度更大，是小肝癌的两倍，II、III级肝癌比I级肝癌表达 下调幅度大，ΠΙΑ、IV级肝癌比I、II级肝癌表达下调幅度大，且ANXA10表达的下调和P53 的突变的协同作用暗示着肝癌的分期更高，预后更差；结果显示ΑΝΧΑ10在肝脏中有表达并 且其表达有一定的组织特异性，它可能是肝细胞分化和生长停止的标记，ΑΝΧΑ10的下调和 肝癌细胞的恶性表型、血管侵袭W及肿瘤进展有关化imJ，KimMA，JeeCD，etal.Re化ced expressionandhomozygousdeletionofannexinAlOingastriccarcinoma.Int. J.Cancer，2009,125, 1842 - 1850.)。目前在绵羊上尚未发现有关ANXAIO对免疫性状调控 影响的研究报道。
[0009] 通过W上资料我们可W得出ANXA10基因参与动物肿瘤等疾病的发生和免疫调 控。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基 因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊ANXA10基因完整 cDNA序列的克隆和SNP筛查、检测及与免疫性状关联分析。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克隆绵羊ANXA10基因的完整cDNA序列，寻找ANXA10基因的突 变位点W及基因的多态性的检测方法，建立一种非诊断目的的适用于绵羊免疫性状的分子 标记，筛选方法方法及在关联分析中的应用。
[0011] 本发明通过W下技术方案实现：
[0012] 从绵羊ANXA10基因片段中克隆得到一种非诊断目的的绵羊免疫性状相关的分子 标记，它的完整cDNA序列如序列表SEQIDNO:1和图1所示，它的部分DNA序列如序列表 SEQIDN0:2和图2所示。在SEQIDN0:2所示序列的第275位碱基处有一个C/T碱基突 变，该突变位于第3外显子内，导致化ηI-RFLP多态性。
[001引申请人设计了一对克隆绵羊ΑΝΧΑ10基因完整cDNA的引物序列，扩增得到的完整cDNA序列如SEQIDNO:1所述。同时申请人设计了一对包含第3外显子的用于扩增绵羊 ANXA10基因组序列的引物，该引物扩增的序列如SEQIDNO:2所述。
[0014] 申请人提供了一种筛选上述分子标记的方法，所述的方法包括W下步骤：<