锌指蛋白33b基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，具体涉及 牛锌指蛋白33B基因片段的克隆及其在牛超数排卵性状标记辅助选择中用途，属于动物基 因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 锌指蛋白家族是含有通过结合Zn2+稳定的、短的、可以自我折叠形成"手指"结 构的一类蛋白质。由于其自身的结构特点，可以选择性的结合特异的靶结构，使锌指 蛋白在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用（Klug A等，Zinc fingers: a novel protein fold for nucleic acid recognition. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 52: 473 - 482)。Elena Labarta等（Elena Labarta 等，Hormonal and molecular characterization of follicular fluid, cumulus cells and oocytes from pre-ovulatory follicles in stimulated and unstimulated cycles. Hum R印rod. 2012 (6): 1596-1605)报道，锌指蛋白338(2似^游）作为锌指蛋白家族成员 之一，在超数排卵后的人类颗粒细胞中显著的下调表达，表明其在卵母细胞成熟过程中具 有潜在作用，而卵母细胞成熟则直接关系到超数排卵的实际效果。因此，蓮因可以 被选定为影响超数排卵性状的候选基因，其单核苷酸遗传多态性可作为动物繁殖和生产性 能辅助选择的分子标记。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应 用，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。
[0004] 本发明的技术解决方案如下： 本发明所述的锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的应用，其特征在于： 该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1 ;在序列表SEQ ID NO: 1第403位存 在G-T的碱基突变，该突变导致/^A4/-RFLP多态性的产生。
[0005] 扩增本发明所述分子标记的引物一对，其DNA序列如下所示： ZNF33B-F: 5' - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3' （正向引物） ZNF33B-R: 5' - GGTTCTGTTCTTGATTTGC -3' （反向引物） 本发明提供的锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记的方法，包括以下步 骤： 通过设计特异性引物一对，正向引物ZNF33B-F: 5' - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3'和反 向引物ZNF33B-R: 5'- GGirCTGTTCTTGAITTGC -3'，从牛血液中提取基因组DNA，进行PCR 扩增，获得因片段的DNA序列，如表SEQ ID NO: 1 ;利用限制性内切酶/检测 PCR产物片段的DNA序列第403位的G-T碱基突变，PCR扩增产物经酶切产生三种基 因型，经2%琼脂糖凝胶电泳可明显判别不同带型，将检测结果所示的不同基因型与牛超数 排卵性状关联分析，具备特定的基因型的个体将获得更好超数排卵效果。
[0006] 本发明对牛因部分DNA序列的克隆：PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电 泳检测结果显示为特异性PCR产物，如图1所示。将PCR产物回收测序，结果显示产物长度 为620bp。测序结果显示该片段403bp处存在T、G两个等位基因，部分测序峰如图3所示。
[0007] 针对牛因部分DNA片段PCR-RFLP诊断方法的建立：用本发明设计的特 异性引物扩增牛基因组DNA得到的620bp特异扩增片段。测序的结果发现在该403bp片段 存在的突变会导致酶切位点（GACNN'NNGTC)，其中第399bp-400bp处为酶切位点。扩 增产物经过限制性内切酶酶切可产生三种基因型，即TT型、TG型和GG型，具体如图 2所示。
[0008] 对标记性状进行关联分析：本发明中牛因的扩增序列作加/多态位点与 牛超数排卵性状的关联分析结果表明，此酶切位点不同基因型所对应的个体的部分超数排 卵性状存在显著或极显著的差异。
[0009] 本发明的积极效果在于：公开了锌指蛋白33B基因作为牛超数排卵性状分子标记 的应用，该分子标记的核苷酸序列第403位存在G-T的碱基突变，该突变导致/^A4/-RFLP 多态性的产生，鉴定其特定的突变位点以作为牛超数排卵性能相关基因的多态性检测方 法，为牛标记辅助育种提供一种有意义的分子标记。
【附图说明】
[0010] 图1是蓮因扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中M泳道为标准 分子量Marker，1-15泳道为被检测的15个PCR产物。
[0011] 图2是2%琼脂糖凝胶电泳检测因扩增产物的酶切结果。其中M 泳道为标准分子量Marker。泳道5为GG型个体；泳道1、2、4、7、8、10、11、12、13为了6型个 体；泳道3、6、9、14、15为IT型个体。
[0012] 图3是本发明扩增的因部分DNA序列中突变位置的克隆测序峰图。
[0013] 图4是实施例2中PCR扩增产物的1. 5%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标 准分子量Marker，泳道1-16为被检测的PCR产物。
[0014]图5是实施例2中酶切反应产物的2%琼脂糖凝胶检测结果。其中M泳道为标准 分子量Marker，泳道1-16为被检测的酶切产物。其中1、6、7、14泳道为TT型个体；2、3、5、 9、10、11泳道为GG型个体；4、8、12、13、15、16泳道为TG型个体。
【具体实施方式】
[0015] 为了更清楚地理解本发明，用【具体实施方式】详细描述具体内容。
[0016] 实施例1 一、牛因部分DNA片段的克隆 利用01ig〇6.0软件设计特异性引物1对，为保证良好的引物质量，在本发明中，引物由 上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增产物长度为620bp，引物序列如下所示： ZNF33B-V:5? - GGAAGTTAAACAGCCTAGT -3? (正向引物） ZNF33B-R:5? - GGTTCTGTTCTTGATTTGC -3? (反向引物） PCR反应过程中所需要的Taq酶、Buffer、镁离子、dNTP等可自行选择。为较快地获得 良好的结果，本发明选择Biomiga公司的2XBench Top? Taq Master mix进行PCR扩增。 具体反应体系为：2XMaster Mix (产品包装盒内提供，其中含Taq DNA Polymerase 0.05 units/iil，4mM MgCl2,0. 4mM dNTPs) 10.0 ul,正向引物与反向引物(浓度为均为 lOpmol/ yl)各 0.5yl,基因组 DNA 0.5yl (含 10-50ngDNA)，二馏水 8.5yl。PCR 反应条件为： 94°C预变性5分钟，94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环，72°C最 后延伸5分钟。
[0017]二、PCR-RFLP 方法的建立 1、PCR产物的检测 本发明随机抽取441头母牛进行基因组DNA提取，用本发明设计的引物ZNF33B-F和 ZNF33B-R进行扩增，得到620bp的特异性扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示为 特异性PCR产物，见图1，其中M泳道为标准分子量Marker，1-15泳道为被检测的15个PCR 产物。
[0018] 2、针对牛基因部分DNA片段PCR-RFLP诊断方法的建立 用本发明设计的特异性引物ZNF33B-F和ZNF33B-