一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，是一种PCR产物序列分析方法，具体涉及一种两核苷 酸合成焦测序定量检测甲基化的方法。
【背景技术】
[0002] 人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因 时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅 猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相 互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移 到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基础研究方面，DNA的序列分 析是进一步研究和改造目的基因的基础，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用 方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，通过对某一特定疾病的基因组样本中突变基因 型进行大规模鉴定和检测，可以获得与该疾病相关基因型的信息。很多常见疾病的遗传学 影响可归因于有限的等位基因变异。越来越多的证据表明，DNA甲基化参与了胚胎发育、基 因印迹等过程。同时，它在疾病发展中也起着举足轻重的作用。甲基化状态的改变被认为 是引起癌症的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲 基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定（如染色体的不稳定、原癌基因的表达）和 抑癌基因的不表达。
[0003] DNA甲基化分析包括定性与定量分析，目前有很多方法可以选择。基因组DNA经过 亚硫酸氢盐处理后，原始序列中未被甲基化的胞嘧啶（C)残基转化为尿嘧啶（U)，并在PCR 扩增中以胸腺嘧啶（T)出现；而被甲基化的胞嘧啶则保持不变。从亚硫酸氢盐转化这条主 干道出发，之后可以选择限制性酶切分析、实时定量PCR、Sanger测序、焦磷酸测序、以及高 通量DNA测序等。然而，并非所有方法都能提供单个CpG位点的定量数据。样本经亚硫酸氢 盐处理后PCR产物的Sanger测序一度被认为是甲基化分析中的金标准，但如果对5-10个 克隆测序，这种方法充其量只是半定量。高通量DNA测序对于甲基化研究，带来了非常灵敏 的DNA甲基化图谱，以单分子分辨率覆盖整个CpG岛。高通量DNA技术实现了整个CpG岛 的更全面覆盖，且单分子分辨率为甲基化模式的异质性提供了前所未有的信息。它能够平 行研究多个位点。然而，这些优点也伴随着一些劣势，比如相当大的一笔投资、试剂昂贵、周 转时间长、数据分析要求高等。这些特点使得高通量DNA测序技术更适用于在基因组范围 内目标区域的确定，而对不同样品在目标区域的CpG位点的定量分析由于样品数量大，如 果每个样品都采用高通量DNA测序技术进行分析，则成本就会过于巨大。
[0004] 传统的焦磷酸测序技术能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进 行定性及定量检测。样本经过亚硫酸氢盐处理后的PCR产物在焦测序延伸过程中，根据C 和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确 检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。德国汉 诺威医学院Potapova领导的研究小组对高通量DNA测序和焦测序进行了系统的交叉验证 (BMC Biotechnology，2011，11:6)，对10个原发性肝癌标本中12个位点的甲基化模式在高 通量DNA测序所获得的单个CpG位点的甲基化水平与传统焦测序相应值进行比较的统计分 析表明，所有单个CpG位点的甲基化水平都有着极佳的一致性。表明传统的焦测序技术是 一种可用于目标区域的CpG位点定量分析的简单、价格便宜的分析技术。
[0005] 然而，传统焦测序技术由于每个反应需要加入相应体积的dNTP，这样，随着测序反 应的进行，反应物的体积越来越大，其反应物的浓度也就越来越少，测序的准确性也就越来 越低。传统焦测序一般在优化核苷酸加入顺序的前提下也只能测定大约60bp的片段长度 (Mashayekhi F，Ronaghi M.A. Analytical biochemistry, 2007, 363, 275-28719)，而这种每 个甲基化位点需要两个测序反应的实现的传统焦测序技术对甲基化PCR产物的分析就更 加受到测序长度的限制。一种变通的方法是将这段长序列用多个测序引物分段进行焦测 序。然而，一方面，使用多个测序引物也会增加分析成本；另一方面，由于经过亚硫酸氢盐 处理后被甲基化的胞嘧啶则保持不变，因此每个位点被甲基化的程度不同，PCR产物中两种 DNA模板的含量也就不同，造成DNA模板类型的复杂，一般很难设计多个测序引物将其序列 分段进行测定。因而传统焦测序在对长片段序列甲基化的定量检测中存在不足。最近，我 们实验室提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法，该方法通过每次反应同时加入两种 dNTPs合成测序，得到两组编码，然后解码这两组编码便能确定测序片段的具体碱基信息 (肖鹏峰等，中国发明专利：ZL 2012 1 0128597.6)。该方法具有大幅提高测序长度，且测 序得到的测序信号强度比传单核苷酸合成测序的信号强等特点。然而，该发明专利只针对 一个DNA模板样本进行分析，无法对包含多个甲基化的DNA模板序列进行分析，限制了序列 分析的范围。由于经过亚硫酸氢盐处理后的PCR产物需要区分C、T碱基，而（dATPa S+dGTP) 合成焦测序没有办法区分这两种碱基，因此，两核苷酸的测序不包括这组组合形式。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种两核苷酸合成焦测序定量检测 甲基化的方法，为样本经过亚硫酸氢盐处理后的PCR产物提供一种快速、高效、灵敏的甲基 化定量分析方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] -种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：其步骤包括：1) DNA提取；2)亚硫酸氢盐处理；3) PCR扩增；4)测序；5)关联分析；
[0009] 所述步骤4)的测序方法为：每个测序反应同时加入两种不同的核苷酸，得到由连 续单个测序信息构成的一组测序编码信息。
[0010] 所述步骤4)的具体方法包括以下步骤：
[0011] 4-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素 修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0. 05-0. 2M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA 链清除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板；
[0012] 4-2)测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C 下放置5-10min，自然冷却至室温，完成杂交；
[0013] 4-3)测序：配备测序反应体系，与所述步骤3-2)得到的杂交产物混合，单个测序 反应选择两核苷酸组合为（dATP a S+dCTP)、（dATP a S+dTTP)、（dGTP+dITP)、（dCTP+dGTP)、 (dCTP+dTTP)之一进行；连续测序反应选择不同的两组两核苷酸组合循环进行，或者根据 分析的目标序列优化两核苷酸加入的顺序进行。
[0014] 所述步骤4-2)中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的一段序列。
[0015] 所述步骤4)中，每个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类信息和测序信 号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强 度均能够转化为核苷酸合成的数目。
[0016] 所述步骤5)中，根据两核苷酸合成焦测序得到的一组测序反应获得编码信息，测 序信号强度信息是包含零的正整数，或者是正非整数。
[0017] 所述步骤5)的具体步骤为：
[0018] 假定DNA分析片段内所有GC位点碱基"C"全被甲基化，得到一条100%被甲基化 的DNA模板1序列，并转化成相应两核苷酸合成焦测序的最大一阶的整数编码信息；同时， 假定DNA分析片段内所有GC位点基"C"全未被甲基化，得到一条100%未被甲基化的DNA 模板2序列，并转化成相应两核苷酸合成焦测序的最大一阶的整数编码信息；
[0019] 所述关联分析为：假定容易一个GC位点中C被甲基化的程度为Xl，