一种快速鉴定烟粉虱钠离子通道基因突变l925i的引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速鉴定烟粉虱Para钠离子通道基因突变L925I的引物及其应 用，特别涉及烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)Para钠离子通道基因突变L925I的鉴定 引物及其在拟除虫菊酯类杀虫剂抗性监测中的应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 烟粉虱B. tabaci是一种重要的大田及温室害虫，常年给观赏花卉、蔬菜以及棉花 生产造成严重损失。由于具有快速的适应能力，烟粉虱已对各类杀虫剂产生了高水平抗性， 是唯一被科技界冠以"超级害虫"称号的害虫。拟除虫菊酯类杀虫剂是人类利用化学手段 模拟天然除虫菊素的化学结构而仿生合成的一类化合物。该类杀虫剂作为一类神经毒剂， 主要作用于昆虫的钠离子通道，延长钠离子通道开放时间，延迟钠通道的失活过程，产生 持久活化，导致重复后放和神经传导的阻断，引起害虫兴奋过度，最终使其肌肉瘫痪并导致 死亡。
[0003] 拟除虫菊酯类杀虫剂作为一类广谱性杀虫剂，具有高效、低毒和低残留的特性，在 农业、林业和卫生害虫防治中广泛应用。但该类杀虫剂作为单剂使用时抗性风险极高，极易 引发害虫的击倒抗性（Knock-down resistance，kdr)。通过药理学实验证明钠离子通道有 选择地改变杀虫剂的结合部位能够降低钠离子对拟除虫菊酯类杀虫剂的亲和力，引起害虫 神经敏感性的改变。目前已在14种昆虫的Para直向同源钠离子通道中发现了 20个突变 位点，其中有5个突变位点为kdr突变位点，7个位点为超击倒抗性（super-kdr)突变位点 (其中包括L925I突变）。在烟粉虱中也已证实钠离子通道蛋白在925位的亮氨酸到异亮 氨酸（L925I)的突变与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性密切相关。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种快速鉴定烟粉虱钠离子通道基因突变位点 L925I的引物及其应用。
[0005] -种快速鉴定钠离子通道基因突变位点L925I为野生型烟粉虱的引物，该引物为 一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0006] 上述引物在鉴定钠离子通道基因突变位点L925I为野生型烟粉虱中的应用。
[0007] 上述应用，步骤如下：
[0008] (1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
[0009] (2)以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩 增，制得PCR扩增产物；
[0010] (3)对步骤⑵制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图 谱显示被测样品有106bp的一条条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点L925I为 野生型的纯合或杂合烟粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无106bp的条带时，则被检测样品钠 离子通道基因突变位点L925I为纯合突变型的烟粉虱。
[0011] 所述步骤（2)中PCR扩增的扩增体系为：
[0012] 基因组 DNA 溶液 2 y 1，10M 上游引物 0. 5 y 1，10M 下游引物 0. 5 y 1，5U/ y 1 rTaq 酶 0? 25 y 1，10 X Taq Buffer (缓冲液）2. 5 y 1，lOmM dNTP 2 y 1，ddH20 补至 25 y 1 ;
[0013] 所述步骤⑵中PCR扩增的扩增条件如下：
[0014] 94°C预变性3分钟；94°C变性15秒，55°C退火10秒，72°C延伸10秒，进行35个循 环；72 °C延伸7分钟。
[0015] -种快速鉴定钠离子通道基因突变位点L925I为突变型烟粉虱的引物，该引物为 一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0016] 上述引物在鉴定钠离子通道基因突变位点L925I为突变型烟粉虱中的应用。
[0017] 上述应用，步骤如下：
[0018] (1)提取待鉴定样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
[0019] (2)以步骤（1)制得的基因组DNA为模板，利用上述引物对基因组DNA进行PCR扩 增，制得PCR扩增产物；
[0020] (3)对步骤⑵制得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当PCR产物电泳图 谱显示被测样品有106bp的一条条带时，则被检测样品钠离子通道基因突变位点L925I为 突变型的纯合或杂合烟粉虱；当PCR产物电泳图谱显示无106bp的条带时，则被检测样品钠 离子通道基因突变位点L925I为纯合野生型的烟粉虱。
[0021] 所述步骤（2)中PCR扩增的扩增体系为：
[0022] 基因组 DNA 溶液 2 y 1，10M 上游引物 0? 5 y 1，10M 下游引物 0? 5 y 1，5U/ y 1 rTaq 酶 0? 25 y 1，10 X Taq Buffer (缓冲液）2. 5 y 1，lOmM dNTP 2 y 1，ddH20 补至 25 y 1 ;
[0023] 所述步骤⑵中PCR扩增的扩增条件如下：
[0024] 94°C预变性3分钟；94°C变性15秒，55°C退火10秒，72°C延伸10秒，进行35个循 环；72 °C延伸7分钟。
[0025] 上述步骤（1)中提取温室白粉虱和烟粉虱基因组DNA和步骤（3)中琼脂糖凝胶电 泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指 南》第三版（北京：科学出版社，2002)。
[0026] 本发明所述L925I突变位点指烟粉虱Para钠离子通道基因片段（GenBank登录 号：AJ440727. 1)自5'末端起第61位核苷酸为A，烟粉虱钠离子通道基因片段（野生型） 核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0027] 本发明所述烟粉虱Para钠离子通道蛋白的L925I突变位点，为烟粉虱Para钠离 子通道蛋白（GenBank登录号：CAD29437. 1)自N端起第21位氨基酸为异亮氨酸，所述烟粉 虱Para钠离子通道蛋白（野生型）氨基酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0028] 有益效果
[0029] 本发明首次公开了检测烟粉虱对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗药性的点突变的两 对检测引物及检测方法，采用两对引物进行检测，不仅有助于提高检测的准确率，并且有助 于快速、灵敏地检测田间烟粉虱对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性发生发展动态，为抗药性 的治理提供技术支持，便于及时调整烟粉虱防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。
【附图说明】
[0030] 图1为采用L925I突变位点专用野生型引物对和专用突变型引物对PCR扩增925 纯合野生型和纯合突变型模板的电泳图；
[0031] 图中：WT，MT分别所示为纯合野生型个体的DNA模板和纯合突变型个体的DNA模 板；
[0032] 图2为实施例2检测结果电泳图；
[0033] 图中：L925I专用野生型引物对WF(SEQ ID NO :1)+R(SEQ ID N0 :2)用以检测925 位点野生型的烟粉虱；L925I专用突变型引物对MF(SEQ ID N0:3)+R(SEQ ID N0:2)用以检 测存在925位点突变的烟粉虱。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0035] 对2014年采自山东省寿光、济南、青岛市三地的田间种群烟粉虱钠离子通道925 位的突变情况进行测序检测，纯合野生型个体的DNA模板，标记为WT ;纯合突变型个体的 DNA模板，标记为MT。
[0036] 实施例中所述材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例1
[0038] 烟粉虱钠离子通道基因L925I野生型和突变型模板的测序验证
[0039] 根据NCBI所公布的烟粉虱钠离子通道基因（Genbank:DQ205209. 1)设计特异性引 物，对925位突变进行PCR扩增，回收专一目的片段后直接进行PCR测序。
[0040] PCR扩增的引物：
[0041] 上游引物：GGCCAACTTTGAATCTGTT ;
[0042] 下游引物：AAACTTTCCGCACCTCTG。
[0043] PCR扩增体系：基因组DNA溶液2yl，10M上游引物lyl，10M下游引物lyl， 5U/ y 1 rTaq 酶 0? 25 y 1，10 X Taq Buffer (缓冲液）2. 5 y 1，10mM dNTP 2 y 1，ddH20 补至 25 y 1 ；
[0044] PCR扩增条件：94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30 秒，进行35个循环；72 °C延伸7分钟。
[0045] 根据以上所述，从三个田间种群中分别随机测序检测15头田间种群烟粉虱个体 DNA序列。挑选出925位的野生型纯合个体（WT)和突变型的纯合个体（MT)。从纯合野生 型个体和纯合突变型个体中分别随机选取5个模板，进行PCR法验证试验。
[0046] 引物设计
[0047] 引物核苷