鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物领域中鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物及 其应用。
【背景技术】
[0002] 目前在国内生肉和肉制品的生产和销售领域，一些不法商贩为了牟取暴利，利用 掺杂掺假等手段欺骗消费者的事件时有发生。因此一套快速、准确鉴别肉种类，并且能够适 应混合肉制品鉴定的方法，无疑会为执法人员提供了强大的技术支撑。
[0003] 传统的肉制品鉴定的方法主要是基于蛋白质水平的分析，包括电泳法、免疫法、 ELISA等技术。操作过程中首先需制备相应物种的抗体，然后抗原和抗体间进行免疫反应， 最后通过电泳或者显色等方法进行鉴别。这类鉴别技术受蛋白质（主要起作用的部分为抗 原决定簇）结构的影响很大，实际应用中经常出现的问题包括：1.热加工过程会改变蛋白 质（抗原决定簇）的结构，因而无法检测热加工的肉类；2.对混合肉类的检测可能出现交 叉反应，因为不同物种蛋白质的结构可能具有某种程度的相似性，检验的灵敏程度取决于 制备的抗体的特异性强弱。
[0004] 环介导核酸等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是 2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特 异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件（63°C左右）保温30 - 60分钟，即可完成 核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。 LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。LAMP技术中，引物是 决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种可特异性检测鼠源成分的鉴定或辅助鉴 定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物。
[0006] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物由引 物F2-1、引物B2-1、引物Flc-1、引物Blc-1、引物F3-1、引物B3-1、引物loopF-1和引物 loopB-1这八条引物组成；
[0007] 所述引物F2-1是SEQ ID No. 1所示的单链DNA，所述引物B2-1是SEQ ID No. 2 所示的单链DNA，所述引物Flc-1是SEQ ID No. 3所示的单链DNA，所述引物Blc-1是SEQ ID No. 4所示的单链DNA，所述引物F3-1是SEQ ID No. 5所示的单链DNA，所述引物B3-1是 SEQ ID No. 6所示的单链DNA，所述引物loopF-1是SEQ ID No. 7所示的单链DNA和所述引 物loopB-1是SEQ ID No. 8所示的单链DNA。
[0008] 上述环介导等温扩增成套引物中，各引物的摩尔比可为4-8mol引物F2-1 :4-8mol 引物B2-1 :4-8mol 引物Flc-1 :4-8mol 引物Blc-1 :lmol 引物F3-1 :lmol 引物B3-1 :2mol 引 物 loopF-1 :2mol 引物 loopB-1，如 8mol 引物 F2-1 :8mol 引物 B2-1 :8mol 引物 Flc-1 :8mol 引物 Blc-1 :lmol 引物 F3-1 :lmol 引物 B3-1 :2mol 引物 loopF-1 :2mol 引物 loopB-1。
[0009] 上述环介导等温扩增成套引物中的八条引物可分别单独包装，使用前混合在一 起。
[0010] 本发明还提供了鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增试剂或试剂盒。
[0011] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增试剂或试剂盒包括 甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg 2+和上述环介导等温扩增成套引物。
[0012] 上述环介导等温扩增成套引物在制备鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0013] 上述环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定鼠源成分中的应用也属于本发 明的保护范围。
[0014] 上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒在鉴定或辅助鉴定鼠源成分中的应 用也属于本发明的保护范围。
[0015] 上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物和上述鉴定或辅助鉴 定鼠源成分试剂或试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0016] 上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物的制备方法，包括将各 条引物分别单独包装或按照所述摩尔比混合在一起的步骤。
[0017] 上述鉴定或辅助鉴定鼠源成分试剂或试剂盒的制备方法，均包括将各条引物分别 单独包装或按照所述摩尔比混合在一起的步骤。
[0018] 上述环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是 否掺杂鼠源成分中的应用也属于本发明的保护范围；所述待测动物组织和/或器官含有下 述至少一种动物的组织和/或器官：牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴。
[0019] 上述环介导等温扩增成套引物在鉴定或辅助鉴定待测动物组织和/或器官中是 否掺杂鼠源成分中的应用也属于本发明的保护范围；所述待测动物组织和/或器官为下述 至少一种动物的组织和/或器官：牛、羊、猪、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴。
[0020] 本发明中，所述鼠源成分可为来自鼠的组织和/或器官和/或细胞，具体可为肌肉 组织、结缔组织（如血液）、毛和/或皮。
[0021] 实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物可特异 性检测鼠源成分，对牛源成分，猪源成分，羊源成分，鸡源成分，鸭源成分，犬源成分，狐狸源 成分，貉子源成分，水貂源成分和驴源成分均无交叉反应。本发明的鉴定或辅助鉴定鼠源成 分的环介导等温扩增成套引物可灵敏地检测掺杂鼠源成分的动物样品，在牛源成分和羊源 成分中添加微量的鼠源成分（鼠源成分含量为0.5% )也可有效地检测出鼠源成分。
【附图说明】
[0022] 图1为成套LAMP引物1与靶序列的匹配图。
[0023] 图2为成套LAMP引物2与靶序列的匹配图。
[0024] 图3为成套LAMP引物1对11种纯肉样品DNA的扩增结果。
[0025] 图4为成套LAMP引物3对11种纯肉样品DNA的扩增结果。
[0026] 图5为成套LAMP引物1对牛肉+5%鼠肉样品DNA、牛肉+1 %鼠肉样品DNA、牛肉 +0? 5%鼠肉样品DNA和牛肉（纯肉）样品DNA的扩增结果。
[0027] 图6为成套LAMP引物1对羊肉+5%鼠肉样品DNA、羊肉+1 %鼠肉样品DNA和羊肉 +0? 5%鼠肉样品DNA羊肉（纯肉）样品DNA的扩增结果。
[0028] 图7为成套LAMP引物2对11种纯肉样品DNA的扩增结果。
[0029] 图8为成套LAMP引物4对11种纯肉样品DNA的扩增结果。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031 ] 下述实施例中的鼠肉为昆明种小白鼠肉，牛肉为黄牛肉，猪肉为东北民猪肉，羊肉 为小尾寒羊肉，鸡肉为白羽鸡肉，鸭肉为北京鸭肉，狗肉为松狮犬肉，狐狸肉为蓝狐肉，貉肉 为乌苏里貉肉，貂肉为美国短毛黑貂肉，驴肉为新疆驴肉。
[0032] 实施例1、环介导等温扩增检测鼠源成分
[0033] -、制备鉴定或辅助鉴定鼠源成分的环介导等温扩增成套引物
[0034] 比较鼠、猪、牛、羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、貂和驴的线粒体DNA序列，用软件设计 LAMP引物，选出针对SEQ ID No. 9的鼠特异保守序列（靶序列）的4套候选的LAMP引物， 分别命名为成套LAMP引物1、成套LAMP引物2、成套LAMP引物3和成套LAMP引物4。
[0035]成套LAMP引物1 (简称八引物组1)由表1中的引物F2 (简称F2-1)、引物B2 (简 称B2-1)、引物Flc (简称Flc-1)、引物Blc (简称Blc-1)、引物F3 (简称F3-1)、引物B3 (简 称B3-1)、引物loopF(简称loopF-1)和引物loopB (简称loopB-1)这八条引物组成，这八 条引物的摩尔比为8:8:8:8 :1:1:2:2。
[0036]成套LAMP引物2 (简称八引物组2)由表2中的引物F2 (简称F2-2)、引物B2 (简 称B2-2)、引物Flc (简称Flc-2)、引物Blc (简称Blc-2)、引物F3 (简称F3-2)、引物B3 (简 称B3-2)、引物loopF(简称loopF-2)和引物loopB (简称loopB-2)这八条引物组成，这八 条引物的摩尔比为8:8:8:8 :1:1:2:2。
[0037] 成套LAMP引物3 (八引物组1的对照）由表1中的引物FIP、引物BIP、引物F3 (简 称 F3-1)、引物 B3 (简称 B3-1)、引物 loopF (简称 loopF-1)和引物 loopB (简称 loopB-1) 这六条引物组成。这六条引物的摩尔比为8:8:1:1:2:2。
[0038] 成套LAMP引物4(简称八引物组2的对照）由表2中的引物FIP、引物BIP、引 物F3 (简称F3-2)、引物B3 (简称B3-2)、引物loopF (简称loopF-2)和引物loopB (简称 loopB-2)这六条引物组成。这六条引物的摩尔比为8:8:1:1:2:2。
[0039] 引物的具体序列如表1-表2。其中，