专利名称：环介导等温扩增技术检测西伯利亚立克次体的非诊断性方法
技术领域：
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种改进的环介导等温扩增方法及其在检测西伯利亚立克次体中的应用。
背景技术：
西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)又名北亚蝶传立克次体，通过硬蝶传播引起北亚蝶传立克次体斑疫热(North Asian tick-borne rickettsiosis)或叫北亚蝶传斑疫伤寒(North Asian tick typhus),呈多形态在宿主细胞的胞核内成片积集。经蝶盯咬人体时，把病原体注入人体先在局部淋巴结繁殖，以后释放入血液形成立克次体血症，造成血内内皮细胞炎症，引起各个脏器的功能异常。临床特点有发热、初疮，局部淋巴结肿大 及皮疹等。立克次体在自然界动物宿主与媒介之间维持持久循环。
发明内容
针对现有技术存在必须经电泳凝胶成像才可以观察结果，或浊度仪显示的结果信噪比低的问题，本发明的目的在于提供一种具有操作简单、反应快速、耗时短等优点的环介导等温扩增技术检测西伯利亚立克次体的非诊断性方法。为实现上述目的，本发明涉及环介导等温扩增技术检测西伯利亚立克次体的非诊断性方法，包括以西伯利亚立克次体GltA基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，引物设计包括两个外引物和两个内引物的设计，内引物FIP(上端内引物)包含Flc序列和F2(F2c区域的互补序列)，即5' -Flc-F2;内引物BIP(下端内引物)包含Blc(Bl区域的互补序列)和B2序列，即5' -B1C-B2。外引物为F3和B3序列，能特异结合靶序列上的6个特异区域。选取的保守序列如下5' -GTATTAGCACGGGTATTGCCTCACTTTGGGGACCTGCTCACGGCGGGGCTAATGAAGCGGTAATAAATATGCTTAAAGAAATCGGTAGTTCTGAGTATATTCCTAAATATATAGCTA AA GCTA AGG ATA A A A ATF3 G ATCCATT1AGATTAATGGGTTTTGGTCA TCGTGTATATAAAAACT - F2ATGACCC GCGTG CC GCAGTACTTAAAGAAAC gtgcaaagaagtaFlcTTAAA GGAACTCGGGCAGCTAGACA令 CAATCCGCTCTTACAAATABlc
_Q CAATAGAACTTGA AGCTATCGCTCTTAAAGAl GAATAr TTTTATTGB2AGAGAAAATTAT Al CCAAArGTTGATTTTWTCCG' GTATTATCTATB3AAAGCTATGGGTATACCGTCGCAAATGTTCACTGTACTTTTTGCAATAGCAAGAACCGTAGGCTGGAT-3'设计外引物F3、B3和内引物FIP、BIP为下面序列或其全部对应的互补序列第一组
权利要求
1.环介导等温扩增技术检测西伯利亚立克次体的非诊断性方法，其特征在于，该方法包括 以西伯利亚立克次体GltA基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，设计外引物F3、B3和内引物FIP、BIP为下面序列或其全部对应的互补序列
2.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述外引物内引物=比例范围为I :4 I 12o
3.如权利要求2所述的非诊断性方法，其特征在于，所述外引物内引物=I:8。
4.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增温度为580C 65O。
5.如权利要求4所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增温度为60°C。
6.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增时间为15分钟 60分钟。
7.如权利要求6所述的非诊断性方法，其特征在于，所述环介导等温扩增时间为60分钟。
8.如权利要求I所述的非诊断性方法，其特征在于，所述非诊断性方法包括步骤 ①提取样品DNA:使用基因组DNA提取试剂盒进彳丁 DNA的提取；②利用所述外引物F3、B3和内引物FIP、BIP、样品DNA、酶、缓冲液配制25μ L反应体系; ③环介导等温扩增程序； ④电泳检测分析结果或使用荧光定量PCR仪、GenieII直接分析结果。
9.如权利要求8所述的非诊断性方法，其特征在于，所述25μ L反应体系组分如下
10.如权利要求8所述的非诊断性方法，其特征在于，所述等温扩增采用恒温水浴、PCR、Real-time PCR、LC320浊度仪、Geniell，使用仪器GenieII进行扩增时，试剂中加入SYBR Green I染料再进行扩增；使用所述荧光定量PCR仪进行扩增时，试剂中加入SYBRGreen I染料，进行扩增时选用SYBR通道进行荧光信号收集；试剂中加入钙黄绿素进行扩增时选用FAM通道进行荧光信号收集。
全文摘要
本发明公开了一种环介导等温扩增技术检测西伯利亚立克次体的非诊断性方法，以西伯利亚立克次体GltA基因序列作为靶序列，比对后选取保守区域，设计一套引物进行扩增，并优化各反应条件。LAMP作为一种分子生物学检测非诊断性方法，可使用浊度仪、荧光定量PCR仪或GenieII仪器检测荧光信号判断结果，可不需要凝胶成像判断结果，具有快速简便、反应时间短、特异灵敏等独特优势。
文档编号C12R1/01GK102936622SQ201210367029
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月28日 优先权日2012年9月28日
发明者王静, 杨宇, 杨永莉, 刘丽娟, 赵婷婷, 王旺, 王莎莎 申请人:中国检验检疫科学研究院