专利名称：应用基于小麦est序列的黑麦染色体特异分子标记对黑麦5r染色体进行鉴定的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和遗传育种领域，具体涉及基于小麦表达序列标签(expressed sequence tag, EST)序列设计的分子标记，以及这些分子标记在跟踪检测黑麦染色体方面的应用。
背景技术：
小麦的近缘种黑麦cereale L.)具有许多优良的性状，如根系发达、分蘖强、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐盐碱和酸性土壤，尤其是抗多种病害，如小麦白粉病iBlumeriagraminis f. sp. triiici)、条镑病graminis f. sp. triiici )、口十镑病(/*·triticina Eriks.)、杆镑病(/*· graminis Pers. f. sp. triiici )、月星黑糖病(TilletiaControversa Kuhn, TCK)和大麦黄矮病(Barley yellow dwarf virus, BYDV)等。因此，黑麦是对小麦进行遗传改良，拓宽小麦遗传基础，增加小麦栽培品种遗传变异的重要基因源。
黑麦中优异基因向小麦中转移的途径主要是创制一系列小麦/黑麦双二倍体、附加系、代换系和易位系。通过远缘杂交和染色体工程等手段将黑麦染色体导入到小麦背景中，之后，还需要对其进行准确的鉴定，才能有效地加以利用。与细胞学技术和生化标记法相比，分子标记法简单、快速和准确的特点使其广泛地用于检测、跟踪导入小麦背景中的黑麦染色体。然而，目前开发的黑麦染色体的特异标记，多集中在黑麦的IRS染色体上，如SSR 标记 Bmac0213 (参考文献Schneider A and Molnar-Lang Μ. 2008. Polymorphismanalysis using IRS-specific molecular markers in rye cultivars {Secale cerealeL.) of various origin. Cereal Res Commun, 36: 11-19), SSAP 标记 S10, S20, S17 (参考文献:Nagy ED and Lelley T. 2003. Genetic and physical mapping of sequencespecific amplified polymorphic (SSAP) markers on the IRS chromosome arm in awheat background. Theor Appl Genet, 107: 1271-1277)，EST-STS 标记 STSwe3 和 STSwel26(参考文献Wang CM, Li LH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF, andAn DG. 2009. Developmentand application of EST-STS markers specific to chromosome IRS of Secale cereale.Cereal Research Communications 37: 13-21)等。Zhuang 等(2008)报道了 1R,4R,5R,7R 染色体特异的 EST-SSR 标记(参考文献Zhuang LF, Song LX, Feng YG, Qian BL,Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ. 2008. Development and chromosome mapping of new wheatEST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added inwheat. Acta Agron Sin, 34: 926-933)。Lee 等(2009)还报道了 6 个 2RL 染色体特异的EST标记(参考文献Lee TG, Hong MJ, Johnson JW, Bland DE, Kim DY, Seo Yff. 2009.Development and functional assessment of EST—derived 2RL_specific markers for2BS. 2RL translocations. Theor Appl Genet, 119: 663-673)。以普通小麦EST序列开发分子标记，这样的分子标记在其近缘物种中表现出很高的可转移性(参考文献Zhang LY, Bernard M, Leroy P, Feuillet C，Sourdille P.2005. High transferability of bread wheat EST-derived SSRs to other cereals.Theor Appl Genet, 111: 677-687)。Zhang 等(2007)(参考文献Zhang LY, Bernard M,Ravel C, Balfourier F, Leroy P, Feuillet C, Sourdille P. 2007. Wheat EST-SSRsfor tracing chromosome segments from a wide range of grass species. PlantBreeding, 126: 251-258)进一步报道了小麦的EST标记能够被用来跟踪其许多近缘种的染色体片段。因此，利用小麦的EST序列来开发黑麦染色体特异的分子标记十分可行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一套基于小麦染色体上的EST序列而设计开发出的黑麦染色体特异的分子标记，借助这些分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的IR 7R全部黑麦染色体，为黑麦染色体上的有益基因转移到栽培小麦背景中提供简便有效的分子鉴定方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是
基于小麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，这些分子标记为根据小麦染色体上的EST序列而设计的正向引物和反向引物，这些分子标记为用于鉴定黑麦IR 7R染色体的特异标记，其碱基序列见表1，
表1.根据小麦染色体表达序列标签序列而设计的17对标记引物序列
权利要求
1.应用基于小麦EST序列的黒麦染色体特异分子标记对黒麦5R染色体进行鉴定的方法，其特征步骤包括 A、分子标记的选定和制备合成标记引物“11-MAG1242”，其正向引物序列见SEQ IDNO :21，其反向引物序列见SEQ ID NO 22 ； B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成IOOmmolじ1的母液放入-20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成IOmmolじ1的工作液待用；其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol じ1 Tris-HCl 与 Immol じ1 EDTA, pH=8. 0 ； C、黒麦染色体的特异标记 C-1、模板DNA的提取取待测物——小麦与黒麦的远缘杂交后代材料，对照物0——不包含待测黑麦染色体的样品，对照物I——包含待测黑麦染色体的样品，然后利用常规DNA提取方法分别提取三者的DNA ； C-2、PCR扩增以C-1所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对待测物、对照物0及对照物I进行扩增； C-3、扩增产物的检测非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤C-2所得的扩增产物，用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相； C-4、结果比对将待测远缘杂交后代材料的电泳图谱分别与对照物O、对照物I的电泳图谱进行比对，如果待测远缘杂交后代材料和对照物I的电泳图谱均有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中有待测黑麦染色体；如果待测远缘杂交后代材料的电泳图谱与对照物0的电泳图谱一致，均不含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中不含有待测黑麦染色体。
2.根据权カ要求I所述的对黒麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于步骤C-2中对所述待测物、对照物0及对照物I的DNA模板进行扩增的具体操作为，在体积为0. 2ml的Eppendof 管中依次加入 30ng 的模板 DNA, I XPCR buffer,1. 5mmol L1 MgCl2, 200mmol L1dNTP，正、反向引物各0. 2mmolじ1，0. 5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10ml，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应。
3.根据权カ要求2所述的对黒麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于所述扩增反应的具体程序为，先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸IminJM环38次；最后72°C延伸lOmin，10°C保存。
4.根据权カ要求I所述的对黒麦染色体进行鉴定的方法，其特征在于步骤C-3中所述扩增产物的检测方法具体为，在步骤C-2所得的扩增产物中加入上样缓冲液2W，混匀之后取3W用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳I 2h。
全文摘要
本发明公开了基于小麦EST序列的黑麦5R染色体特异的分子标记，此分子标记为根据小麦染色体上的表达序列标签序列而设计的正向引物和反向引物，用于鉴定黑麦5R染色体的特异标记；应用这些分子标记对黑麦5R染色体进行鉴定的基本步骤包括A、标记引物的选定和制备；B、标记引物的稀释；C、黑麦染色体的特异标记C-1、模板DNA的提取，C-2、PCR扩增，C-3、扩增产物的检测，C-4、结果比对。本发明基于小麦染色体上的EST序列设计开发出了一套黑麦染色体的特异分子标记，借助此分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的5R黑麦染色体，为黑麦染色体上的有益基因转移到栽培小麦背景中提供了简便有效的分子鉴定方法。
文档编号C12Q1/68GK103045724SQ201210366548
公开日2013年4月17日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者许红星, 尹冬冬, 安调过, 李立会 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所