专利名称：基于黑麦est序列的黑麦2r染色体特异的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和遗传育种领域，具体涉及基于黑麦表达序列标签 (expressed sequence tag, EST)序列设计的分子标记，以及这些分子标记在跟踪检测黑麦染色体方面的应用。
背景技术：
小麦的近缘种黑麦(Secale cerealeL.)具有许多优良的性状，如根系发达、 分蘖强、抗旱、耐瘠薄、耐寒、耐盐碱和酸性土壤，尤其是抗多种病害，如小麦白粉病(Blumeria graminisf. sp. tritici)、条镑病(Puccinia graminis f. sp. tritici)、叶镑病 (P. iriticina Eriks.)、杆镑病(P. graminis Pers. f. sp. tritici)> 渥黑穗病(Tilletia Controversa Kuhn, TCK)和大麦黄矮病(Barley yellow dwarf virus, BYDV)等。因此，黑麦是对小麦进行遗传改良，拓宽小麦遗传基础，增加小麦栽培品种遗传变异的重要基因源。
黑麦优异基因向小麦中转移的途径主要是创制一系列小麦/黑麦双二倍体、附加系、代换系和易位系。通过远缘杂交和染色体工程等手段将黑麦染色体导入到小麦背景中，之后，还需要对其进行准确的鉴定，才能有效地加以利用。与细胞学技术和生化标记法相比，分子标记法简单、快速和准确的特点使其广泛地用于检测、跟踪导入小麦背景中的黑麦染色体。然而，目前开发的黑麦染色体的特异标记，多集中在黑麦的IRS染色体上， 如 SSR 标记 Bmac0213 (参考文献Schneider A and Molnar-Lang Μ. 2008. Polymorphism analysis using IRS-specific molecular markers in rye cultivars(Secale cereale L.) of various origin. Cereal Res Commun, 36:11-19) ;SSAP 标记 S10, S20，S17 (参考文献:Nagy ED and Lelley T. 2003. Genetic and physical mapping of sequence specific amplified polymorphic (SSAP)markers on the IRS chromosome arm in a wheat background. Theor Appl Genet, 107:1271-1277) ;EST_STS 标记 STSwe3 和 STSwel26 (参考文献Wang CM, LiLH, Zhang XT, Gao Q, Wang RF, and An DG. 2009. Development and application of EST-STS markers specific to chromosome IRS of Secale cereale. Cereal Research Communications 37:13-21)等。Zhuang 等(2008)报道了 1R,4R,5R和 7R 染色体特异的 EST-SSR 标记(参考文献:Zhuang LF, Song LX, Feng YG, Qian BL, Xu HB, Pei ZY, Qi ZJ. 2008. Development and chromosome mapping of new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rve chromosomes added in wheat. Acta Agron Sin, 34:926-933)。Lee等(2009)还报道了 6个2RL染色体特异的EST标记(参考文献:Lee TG, Hong MJ, Johnson Jff, Bland DE, Kim DY, Seo Yff. 2009. Development and functional assessment of EST—derived 2RL_specific markers for 2BS. 2RL translocations.Theor Appl Genet, 119:663-673)。
然而，到目前为止，还没有人报道来源于黑麦表达序列标签(EST)序列的一套完整的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，以用来检测鉴定小麦背景中的IR 7R全部黑麦染色体。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一套基于黑麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，基于黑麦染色体上的EST序列设计开发出了一套黑麦染色体的特异分子标记，借助这些分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的IR 7R全部黑麦染色体，为黑麦染色体上有益基因转移到栽培小麦背景中提供了简便有效的分子鉴定方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是
基于黑麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记，这些分子标记为根据黑麦染色体上的EST序列而设计的正向引物和反向引物，这些分子标记为用于鉴定黑麦 IR 7R染色体的特异标记，其碱基序列见表1，
表I.根据黑麦染色体上的EST序列设计的14对标记引物序列
标C名ft黑麦染fe 钵EST :ΑΨ}\Μ ·η反l+il·物^列 (5、3，)扩增丨I段 k 小(bp)1CGGI43_RAFI36486Λ SEQ ID NO:I凰 SEQro NO:2150 (IR) / 100(6R)2-CGG622RBE58TO51!ASEQIDNO3 ￡ SEQ ID NO；42903-CGGH2RBE58689I Al SEQ ID NO5 ￡ SEQ ID NO6904CGG92RBE 侧 33 AL SEQ ID NO71AL SEQ ID NO<S2005-CGG323RBE7057661AlSEQ ID NO；9lAi SEQ ID NO；104806-CGG4941BE5X666X1ASEQ ID NOII!Al SEQ ID NO12IiOOO7-CGG4SRBE493824E SEQ ID NO:13SEQ ID NO14200H-CGG16SRBE586813MLSEQ ID NO15见 SEQ ID NO162509-CGGI8SRBE637153W.SEQ ID NO17<41 SEQ ID NO18150IOCGG19SRBE705252见 SEQ ID NO19 Al SEQ ID NO；2020011-CGG43SRBE493766!Al SEQIDNO21E SEQ ID NO:2215012-CGG236RBE704532见 SEQ IDNOt23见 SEQ ID NO:24150I3-CGG596RBE5K6431E SEQ ID NO；25见 SEQ ID NO；2620014-CGG267RBE 柳.)47ftLSEQ ID NO27见 SEQ ID NO:28150
其中，1-CGG143标记用于鉴定黑麦IR和6R染色体；2-CGG62、3_CGG8和4-CGG9标记用于鉴定黑麦2R染色体；5-CGG32标记用于鉴定黑麦3R染色体；6_CGG49标记用于鉴定黑麦4R染色体；7-CGG4、8-CGG16、9-CGG18、10-CGG19和11-CGG43标记用于鉴定黑麦5R染色体；12-CGG23和13-CGG59标记用于鉴定黑麦6R染色体；14_CGG26标记用于鉴定黑麦7R 染色体。其中，“EST” 一列列出了分子标记所对应的黑麦染色体上的EST序列的名称。
应用上述基于黑麦EST序列的黑麦IR 7R染色体特异的分子标记对小麦背景中的黑麦染色体进行鉴定的方法，其步骤包括
A、标记引物的选定和制备根据所需鉴定的黑麦染色体选定分子标记，比如，预备检测小麦与黑麦远缘杂交后代材料当中是否含有黑麦4R染色体，则选定6-CGG49标记，然后根据表I给出的序列合成此标记引物；
B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成ΙΟΟμπιοΙ 的母液放入_20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10 μ mol Γ1的工作液待用；其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol Γ1 Tris-HCl 与 lmmol T1EDTA, pH=8. O ；
C、黑麦染色体的特异标记
C-1、模板DNA的提取取待测物——小麦与黑麦的远缘杂交后代材料，对照物O——不包含待测黑麦染色体的样品，对照物I——包含待测黑麦染色体的样品，然后利用常规DNA提取方法分别提取三者的DNA ；
C_2、PCR扩增以C-I所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对待测物、对照物O及对照物I进行扩增；
C-3、扩增产物的检测非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤C-2所得扩增产物， 用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对将待测远缘杂交后代材料的电泳图谱分别与对照物O、对照物I的电泳图谱进行比对，如果待测远缘杂交后代材料和对照物I的电泳图谱均含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中含有待测黑麦染色体；如果待测远缘杂交后代材料的电泳图谱与对照物O的电泳图谱一致，均不含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中不含有待测黑麦染色体。
作为上述方法的一种优选技术方案，步骤A中选定的标记引物由上海联合基因有限公司合成。
作为上述方法的一种优选技术方案，步骤C-2中对所述待测物、对照物O及对照物 I的DNA模板进行扩增的具体操作为，在体积为O. 2ml的Eppendof管中依次加入30ng的模板 DNA, IXPCR buffer, I. 5mmol L-1MgCl2JOOmmol ΓΜΝΤΡ，正、反向引物各 O. 2 μ mol ΛO.5UTaq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10 μ 1，然后将Eppendof管放在 GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应。
作为上述方法的一种优选技术方案，所述扩增反应的具体程序为，先94°C预变性 5min ;然后94°C变性lmin,根据标记引物的退火温度退火lmin,72°C延伸Imin,循环38次； 最后72°C延伸10min，10°C保存；其中各标记引物的退火温度为，1-CGG143，50°C ;2_CGG62， 60°C ；3-CGG8,62°C ;4_CGG9，56°C ;5_CGG32，55°C ;6_CGG49，55°C ；7-CGG4,60°C ;8_CGG16， 57 °C ；9-CGG18,56 °C ；10-CGG19,58 °C ；11-CGG43,52 °C ；12-CGG23,62 °C ；13-CGG59,51°C ； 14-CGG26，6(TC。
作为上述方法的一种优选技术方案，步骤C-3中所述扩增产物的检测方法具体为，在步骤C-2所得的扩增产物中加入上样缓冲液2 μ 1，混匀之后取3 μ 1，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳I 2h。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于
①本发明开发的14个黑麦染色体的特异分子标记，是序列转化性的标记，比前人所用的RAro标记更加稳定和具有可重复性；标记引物与模板的结合能力较强，能很好地扩增出目标片段，实验条件要求比较宽松；与鉴定外源染色体的C-分带和原位杂交的鉴定方法相比，操作步骤简单，实验技术要求较低，可以简单、快速地鉴定小麦背景中的黑麦染色体；
②本发明开发的14个源于黑麦EST序列的黑麦染色体特异分子标记，覆盖了全部黑麦IR 7R染色体，能够检测鉴定小麦背景中IR 7R全部黑麦染色体，为利用黑麦有益基因改良小麦提供了分子标记辅助选择的基础；
③本发明与前面文献中介绍的基于小麦EST序列开发的黑麦染色体特异的标记相比较，本发明开发的黑麦染色体特异分子标记是来源于黑麦的EST序列，其保守性更强；
④本发明是根据黑麦的EST序列开发的分子标记，在黑麦和小麦之间具有很好的可转移性，这为饱和小麦遗传连锁图谱提供了丰富的标记来源；
⑤本发明开发的分子标记，其序列直接来源于基因的转录区域，这为黑麦功能基因的鉴定奠定了基础。
图I :黑麦5R染色体特异分子标记8-CGG16在帝国黑麦、普通小麦中国春和“中国春-帝国黑麦”二体附加系(1R-7R)中的检测结果；其中，M:markerpUC19/MSpI，箭头示在帝国黑麦和5R附加系中的特异性扩增片段；1 :中国春，2 :帝国黑麦，3 :1R附加系，4 2R附加系，5 3R附加系，6 4R附加系，7 5R附加系，8 6R附加系，9 7R附加系。
图2 :黑麦IR和6R染色体特异分子标记1-CGG143在帝国黑麦、普通小麦中国春和“中国春-帝国黑麦”二体附加系(1R-7R)中的检测结果；其中，M:marker pUC19/MspI, 箭头示在帝国黑麦和1R、6R附加系中的特异性扩增片段；1 :中国春，2 :帝国黑麦，3 :1R附加系，4 2R附加系，5 3R附加系，6 4R附加系，7 5R附加系，8 6R附加系，9 7R附加系。
图3 :黑麦IR和6R染色体特异分子标记1-CGG143在普通小麦“小偃6号”和“德国白”黑麦杂交后代等材料中的检测结果；其中，M marker pUC19/MspI，箭头示特异性扩增片段；1 :中国春，2 :帝国黑麦，3 :小偃6号，4 :德国白黑麦，5 WR64 (小偃6号-德国白 1BL/1RS易位系)，6 :WR81 (小偃6号-德国白1BL/1RS易位系)，7 :WR91 (小偃6号-德国白2R (2D)代换系)，8 :WR41 (小偃6号-德国白4B/4R交互易位系)，9 :洛夫林10 (黑麦 Petkus的1BL/1RS易位系)，10 :洛夫林13 (黑麦Petkus的1BL/1RS易位系)，11 :小黑麦 06CT456 (AABBRR)，12 :小黑麦 06CT461 (AABBRR)。
图4 :黑麦2R染色体特异分子标记2-CGG62在7个黑麦品种、4个小麦近缘种和2 个普通小麦中的检测结果；其中，M marker pUC19/MspI，箭头示特异性扩增片段；1 :中国春，2 :帝国黑麦，3 :小偃6号，4 :德国白黑麦，5 :固原黑麦，6 =King黑麦，7 :美国黑麦，8 :荆州黑麦，9 :奥地利黑麦，10 :冰草，11 :大麦，12 :簇毛麦，13 :偃麦草。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
实施例I :黑麦5R染色体特异分子标记的开发
应用8-CGG16分子标记对黑麦5R染色体进行鉴定的方法，待测材料为“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系，对照材料为帝国黑麦、普通小麦中国春和其余 6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系；其中，“中国春-帝国黑麦”二体异附加系(1R-7R) 为公知公用材料(参考文献Driscoll C J, Sears E R, 1971. Individual additions of the chromosomes of “Imperial，，rye to wheat. Agron Abstr, 1971:6);操作步骤如下
A、标记引物的制备根据8-CGG16标记引物的序列由上海联合基因有限公司合成；
B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成ΙΟΟμπιοΙ 的母液放入_20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10 μ mol Γ1的工作液待用；其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol T1Tris-HCl 与 lmmol T1EDTA, pH=8. O ；
C、黑麦染色体的特异标记
C-1、模板DNA的提取取待测材料“中国春_帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系和对照材料帝国黑麦、普通小麦中国春、其余6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系， 利用常规DNA提取方法分别提取其DNA ；
C_2、PCR扩增以C-I所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系、帝国黑麦、普通小麦中国春、其余6个“中国春_帝国黑麦”二体异附加系进行扩增；扩增实验的具体操作为，取9支体积为 O. 2ml 的 Eppendof 管，向其中依次加入 30ng 的模板DNA, I XPCR buffer, I. Smmol L-1MgCl2, 200mmol I^dNTP,正、反向引物各O. 2 μ mol L_1,0. 5U Taq DNA聚合酶,最后用无菌超纯水补充反应体系至10 μ 1，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应； 扩增反应的具体程序为，先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，根据标记引物的退火温度退火lmin，72°C延伸lmin，循环38次；最后72°C延伸lOmin，10°C保存；其中8-CGG16标记引物的退火温度为57°C;最终获取“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系、帝国黑麦、普通小麦中国春、其余6个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系各自的扩增产物，共计9份；
C-3、扩增产物的检测在步骤C-2所得的9份扩增产物中分别加入上样缓冲液 2 μ 1，混匀之后取3 μ 1，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳I. 5h，然用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对参看附图I,图中M :marker pUC19/MspI,箭头示在帝国黑麦和5R 附加系中的特异性扩增片段；I :中国春，2 :帝国黑麦，3 IR附加系，4 2R附加系，5 3R附加系，6 :4R附加系，7 :5R附加系，8 :6R附加系，9 :7R附加系；8_CGG16在帝国黑麦和“中国春-帝国黑麦”的5R染色体的二体异附加系中均有大约250bp的特异性扩增，而在中国春和其余6个“中国春-帝国黑麦” 二体异附加系均没有该特异性扩增；这表明8-CGG16即为黑麦5R染色体的特异分子标记，可用来对黑麦5R染色体进行快捷、简便的特异跟踪和鉴定。
实施例2 :黑麦IR和6R染色体特异分子标记的开发
应用1-CGG143标记对黑麦IR和6R染色体进行鉴定的方法，待测材料为“中国春-帝国黑麦”的IR和6R染色体的二体异附加系，对照材料为帝国黑麦、普通小麦中国春和其余5个“中国春-帝国黑麦” 二体异附加系；操作步骤如下
A、标记引物的制备根据1-CGG143标记引物的序列由上海联合基因有限公司合成；
B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成ΙΟΟμπιοΙ 的母液放入_20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10 μ mol Γ1的工作液待用；其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol T1Tris-HCl 与 lmmol T1EDTA, pH=8. O ；
C、黑麦染色体的特异标记
C-I、模板DNA的提取取待测材料“中国春_帝国黑麦”的IR和6R染色体的二体异附加系和对照材料帝国黑麦、普通小麦中国春、其余5个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系；利用常规DNA提取方法分别提取其DNA ；
C_2、PCR扩增以C-I所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对“中国春-帝国黑麦”的IR和6R染色体的二体异附加系、帝国黑麦、普通小麦中国春、其余5个“中国春-帝国黑麦” 二体异附加系进行扩增；扩增实验的具体操作为，取9 支体积为O. 2ml的Eppendof管，向其中依次加入30ng的模板DNA, I XPCR buffer, I. 5mmol L^1MgCl2, 200mmol L4dNTP,正、反向引物各 O. 2 μ mol L-1,0. 5U Taq DNA 聚合酶,最后用无菌超纯水补充反应体系至10 μ 1，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应的具体程序为，先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，根据标记引物的退火温度退火lmin，72°C延伸lmin，循环38次；最后72°C延伸lOmin，10°C保存；其中 1-CGG143标记引物的退火温度为50°C ;最终获取“中国春-帝国黑麦”的IR和6R染色体的二体异附加系、帝国黑麦、普通小麦中国春、其余5个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系各自的扩增产物，共计9份；
C-3、扩增产物的检测在步骤C-2所得的9份扩增产物中分别加入上样缓冲液 2 μ 1，混匀之后取3 μ 1，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳I. 5h，然用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对参看附图2,图中M :marker pUC19/MspI,箭头示在帝国黑麦和 1R、6R附加系中的特异性扩增片段；I :中国春，2 :帝国黑麦，3 IR附加系，4 2R附加系， 5 :3R附加系，6 :4R附加系，7 :5R附加系，8 :6R附加系，9 :7R附加系；标记1-CGG143在帝国黑麦和“中国春-帝国黑麦”的IR和6R染色体的二体异附加系中分别有大约150bp和 IOObp的特异性扩增，而在中国春和其余5个“中国春-帝国黑麦”二体异附加系中均没有该特异性扩增；这表明黑麦IR和6R染色体上分别存在标记1-CGG143的扩增位点，可利用I-CGG143对黑麦IR和6R染色体进行快捷、简便的跟踪和鉴定。
实施例3 :黑麦IR和6R染色体特异分子标记的应用
应用1-CGG143标记对普通小麦“小偃6号”和“德国白”黑麦杂交后代等材料中黑麦IR和6R染色体进行鉴定的方法，待测材料为德国白黑麦，WR64 (小偃6号-德国白 1BL/1RS易位系)，WR81 (小偃6号-德国白1BL/1RS易位系)，WR91 (小偃6号-德国白2R (2D)代换系)，WR41 (小偃6号-德国白4B/4R交互易位系);对照材料为中国春，小偃6号， 帝国黑麦，洛夫林10 (Petkus黑麦的1BL/1RS易位系)，洛夫林13 (Petkus黑麦的1BL/1RS 易位系)，小黑麦06CT456 (AABBRR)，小黑麦06CT461 (AABBRR);操作步骤如下
A、标记引物的制备根据1-CGG143标记引物的序列由上海联合基因有限公司合成；
B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成100 μ mol 的母液放入_20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10 μ mol Γ1的工作液待用；其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol T1Tris-HCl 与 lmmol T1EDTA, pH=8. O ；
C、黑麦染色体的特异标记
C-1、模板DNA的提取取待测材料，利用常规DNA提取方法分别提取其DNA，共计 12份；
C-2、PCR扩增以C-I所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中对12份待测样品分别进行扩增；扩增实验的具体操作为，取12支体积为O. 2ml的 Eppendof 管，向其中依次加入 30ng 的模板 DNA, I XPCR buffer, I. 5mmoI L 1MgCl2, 200mmol PdNTP，正、反向引物各O. 2μπι01 Γ',Ο. 5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10 μ 1，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应的具体程序为，先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，根据标记引物的退火温度退火 lmin，72°C延伸lmin，循环38次;最后72°C延伸lOmin，10°C保存;其中8-CGG16标记引物的退火温度为57°C ;最终获取中国春，帝国黑麦，小偃6号，德国白黑麦，WR64 (小偃6号-德国白1BL/1RS易位系)，WR81(小偃6号-德国白1BL/1RS易位系)，WR91(小偃6号-德国白 2R (2D)代换系)，WR41 (小偃6号-德国白4B/4R交互易位系)，洛夫林10 (Petkus黑麦的 1BL/1RS易位系)，洛夫林13 (Petkus黑麦的1BL/1RS易位系)，小黑麦06CT456 (AABBRR), 小黑麦06CT461 (AABBRR)各自的扩增产物，共计12份；
C-3、扩增产物的检测在步骤C-2所得的12份扩增产物中分别加入上样缓冲液 2 μ 1，混匀之后取3 μ 1，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳I. 5h，然用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对参看附图3,图中M :marker pUC19/MspI,箭头示特异性扩增片段；1 :中国春，2 :帝国黑麦，3 :小偃6号，4 :德国白黑麦，5 :WR64(小偃6号-德国白1BL/1RS 易位系)，6:WR81 (小偃6号-德国白1BL/1RS易位系)，7 :WR91 (小偃6号-德国白2R (2D)代换系)，8 :WR41 (小偃6号-德国白4B/4R交互易位系)，9 :洛夫林10 (Petkus黑麦的1BL/1RS易位系)，10 :洛夫林13 (Petkus黑麦的1BL/1RS易位系)，11 :小黑麦06CT456 (AABBRR), 12 :小黑麦06CT461 (AABBRR)； 1-CGG143标记有两个扩增位点，分别位于黑麦IR 和6R染色体上，针对其在黑麦IR染色体上的位点来看，其在帝国黑麦、德国白黑麦、小黑麦 06CT456和06CT461中均扩增出大约150bp的特异片段，同时在WR64、WR81、洛夫林10和洛夫林13这4个1BL/1RS易位系中均扩增出略小于150bp的多态性特异片段，而在其它不携带有IR染色体的材料中均未出现此特异扩增片段；针对1-CGG143标记在黑麦6R染色体上的位点来看，其仅在帝国黑麦、德国白黑麦、小黑麦06CT456和06CT461中扩增出大约IOObp 的特异片段，而在其它所有不携带6R染色体的材料中均未出现该特异扩增片段。鉴定结果与实施例2的结果相一致，说明1-CGG143标记能够很好地用来检测鉴定小麦背景中的IR 和6R的黑麦染色体。
实施例4 :黑麦2R染色体特异分子标记的验证
应用2-CGG62标记对来源不同的黑麦2R染色体进行鉴定，待测材料包括7个黑麦品种；对照材料为4个小麦近缘种以及2个普通小麦；前者包括帝国黑麦，德国白黑麦，固原黑麦，King黑麦，美国黑麦，荆州黑麦，奥地利黑麦；后者包括冰草，大麦，簇毛麦，偃麦草以及中国春，小偃6号，操作步骤如下
A、标记引物的制备根据2-CGG62标记引物的序列由上海联合基因有限公司合成；
B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成ΙΟΟμπιοΙ 的母液放入_20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10 μ mol Γ1的工作液待用；其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol T1Tris-HCl 与 lmmol T1EDTA, pH=8. O ；
C、黑麦染色体的特异标记
C-1、模板DNA的提取取待测材料，利用常规DNA提取方法分别提取其DNA，共计 13份；
C-2、PCR扩增以C-I所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中对13份待测样品分别进行扩增；扩增实验的具体操作为，取13支体积为O. 2ml的 Eppendof 管，向其中依次加入 30ng 的模板 DNA, I XPCR buffer, I. 5mmoI L 1MgCl2, 200mmol PdNTP，标记引物各O. 2μπι01 Γ',Ο. 5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10 μ 1，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应；扩增反应的具体程序为，先94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，根据标记引物的退火温度退火 lmin，72°C延伸lmin，循环38次；最后72°C延伸lOmin, 10°C保存；其中8-CGG16标记引物的退火温度为57°C ;最终获取7个黑麦品种——帝国黑麦，德国白黑麦，固原黑麦，King黑麦，美国黑麦，荆州黑麦，奥地利黑麦；4个小麦近缘种——冰草，大麦，簇毛麦，偃麦草以及 2个普通小麦——中国春，小偃6号，各自的扩增产物，共计13份；
C-3、扩增产物的检测在步骤C-2所得的13份扩增产物中分别加入上样缓冲液 2 μ 1，混匀之后取3 μ 1，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳I. 5h，然用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；
C-4、结果比对参看附图4,图中M :marker pUC19/MspI,箭头示特异性扩增片段；1 :中国春，2 :帝国黑麦，3 :小偃6号，4 :德国白黑麦，5 :固原黑麦，6 =King黑麦，7 :美国黑麦，8 :荆州黑麦，9 :奥地利黑麦，10 :冰草，11 :大麦，12 :簇毛麦，13 :偃麦草；2_CGG62在7 个黑麦品种——帝国黑麦，德国白黑麦，固原黑麦，King黑麦，美国黑麦，荆州黑麦，奥地利黑麦中均有大约250bp的特异性扩增，而在2个小麦及其4个近缘种——中国春，小偃6号； 冰草，大麦，簇毛麦，偃麦草中均没有该特异性扩增。说明应用2-CGG62标记可以很好地对来源不同的黑麦2R染色体进行准确鉴定。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
权利要求
1.基于黑麦EST序列的黑麦2R染色体特异的分子标记，其特征在于该分子标记为根据黑麦染色体上的表达序列标签EST序列设计的正向引物和反向引物，该分子标记为用于鉴定黑麦2R染色体的特异标记，其名称为2-CGG62，其正向引物序列见SEQ ID NO :3，其反向引物序列见SEQ ID NO :4。
2.应用权利要求I所述的分子标记对小麦背景中的黑麦2R染色体进行鉴定的方法，其特征步骤包括A、分子标记的选定和制备根据权利要求I给出的序列合成此标记引物；B、标记引物的稀释将上步合成的标记引物，先用IXTE缓冲液溶解成100μ mol Γ1 的母液放入_20°C的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10 μ mol Γ1的工作液待用；其中 IXTE 缓冲液的配方为，IOmmol T1Tris-HCl 与 lmmol T1EDTA, pH=8. O ；C、黑麦染色体的特异标记C-I、模板DNA的提取取待测物——小麦与黑麦远缘杂交后代材料，对照物O——不包含待测黑麦染色体的样品，对照物I——包含待测黑麦染色体的样品，然后利用常规DNA提取方法分别提取三者的DNA ；C-2、PCR扩增以C-I所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对待测物、对照物O及对照物I进行扩增；C-3、扩增产物的检测非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤C-2所得的扩增产物，用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；C-4、结果比对将待测远缘杂交后代材料的电泳图谱分别与对照物O、对照物I的电泳图谱进行比对，如果待测远缘杂交后代材料和对照物I的电泳图谱均有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中含有待测黑麦染色体；如果待测远缘杂交后代材料的电泳图谱与对照物O的电泳图谱一致，均不含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中不含有待测黑麦染色体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤C-2中对所述待测物、对照物O及对照物I的DNA模板进行扩增的具体操作为，在体积为O. 2ml的Eppendof管中依次加入30ng 的模板 DNA，1XPCR buffer, I. 5mmol L-1MgCl2JQQmmol ΓΜΝΤΡ，正、反向引物各 O. 2 μ mol L'O. 5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10 μ 1，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述扩增反应的具体程序为，先94°C预变性5min ;然后94°C变性Imin,根据标记引物的退火温度退火lmin,72°C延伸Imin,循环38 次；最后72°C延伸lOmin，10°C保存；标记引物的退火温度为60°C。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤C-3中所述扩增产物的检测方法具体为，在步骤C-2所得的扩增产物中加入上样缓冲液2 μ 1，混匀之后取3 μ 1，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150 180V，电泳I 2h。
全文摘要
本发明公开了基于黑麦EST序列的黑麦2R染色体特异的分子标记，该分子标记为根据黑麦染色体上的表达序列标签而设计的正向引物和反向引物，该分子标记为用于鉴定黑麦2R染色体的特异标记；应用该分子标记对黑麦2R染色体进行鉴定的基本步骤包括A、标记引物的选定和制备；B、标记引物的稀释；C、黑麦染色体的特异标记C-1、模板DNA的提取；C-2、PCR扩增；C-3、扩增产物的检测；C-4、结果比对。借助本发明的分子标记能够用普通PCR技术快速、准确的鉴定小麦遗传背景中的2R黑麦染色体，为黑麦染色体上有益基因转移到栽培小麦背景中提供了简便有效的分子鉴定方法。
文档编号C12N15/11GK102925439SQ201210479388
公开日2013年2月13日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者安调过, 尹冬冬, 许红星, 李立会 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所