水稻基因组学的研究方法
【专利摘要】本发明涉及一种水稻基因组学的研究方法，本发明根据粳稻日本晴全基因组BAC序列与籼稻93-11全基因组序列BLAST分析的结果，开发基于籼稻-粳稻第1染色体序列差异的特异InDel标记，还对所设计引物在2个籼稻和5个粳稻品种之间进行多态性鉴定，获得分子标记除了在籼稻-粳稻亚种之间具有多态性之外，一些标记在亚种内也具有多态性，因此这些引物可以用于同一亚种间多态性鉴定。甚至少数标记对来自于同一遗传背景及其相应突变体之间有多态性。可以预见，开发的分子标记在籼稻-粳稻遗传分化、籼稻-粳稻杂种优势的分子机制解释、分子标记辅助育种等方面具有重要利用价值。
【专利说明】水稻基因组学的研究方法
【技术领域】
[0001]水稻基因组学的研究方法，属于基因工程学领域。
【背景技术】
[0002]水稻是最主要的粮食作物之一，也是重要的单子叶模式植物,共有12对染色体，其中第I染色体是最长的，其长度达51.4Mb，约占水稻基因碱基总数的1/10。其中短臂序列长493729bp，约6756个基因，约30%基因(2073个基因)已被功能分类。基因大小的均值是6.4kb。第I染色体是富含G + C的染色体，特别是在编码区，具有几个分散或串联重复序列基因簇分布的特征。已经定位于第I染色体的基因有抗病性基因、白叶枯病抗性基因、稻瘟病抗性基因、抗虫性基因、品质相关性状基因、产量相关性状基因、株型相关性状基因、株闻相关基因、育性相关基因等对水稻广量有很大影响的基因。
【发明内容】
[0003]水稻基因组的成功测序是继完成人类基因组测序后的又一巨大成功。进行水稻基因组及后基因组研究， 对提升我国农作物育种水平和培育新品种具有重要意义，并将帮助全球解决食物问题。
[0004]实验材料
本研究材料包括2个高产籼稻恢复系93-11、Τ13与5个优良粳稻品种空育131、彩、加花I号、合江06、Ri22，用于籼稻-粳稻之间特异性分子标记的筛选。
[0005]实验设计
利用生物信息学的方法，根据粳稻日本晴和籼稻93-11的基因组序列差异来设计InDel标记。日本晴的BAC序列已在染色体上定位，用鸟枪法测序的93-11基因组序列也通过与日本晴的序列比对而被锚定在各个染色体。设计分子标记可按如下操作:
目标区段所包括的日本晴BAC序列
(http://rgp.dna.affrc.g0.jp/cg1-bin/statusdb/irgsp-status.cgi)
I
目标BAC序列与93-11序列比对，筛选特异InDel特异位点 ||(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)
含InDel的日本晴序列(1000bp)
I
软件设计特异InDel引物(长度200_300bp)
I
设计引物特异性的鉴定(http://rapdb.dna.affrc.g0.jp/tools/blast/)
多态性鉴定，获得籼稻-粳稻之间特异InDel标记 实验方法
1、DNA的提取
(1)提取方法
DNA的提取方法有很多种，经典的方法如SDS法，CTAB法等，本研究采用CTAB法进行水稻DNA的提取。将种子在37°C恒温培养箱中萌发后置于25°C温室中生长，当植株长出3_4片叶时，每个水稻品种选择一个单株，取约3g新鲜叶片，分别置于1.5mL的离心管中。将装有叶片的离心管迅速置于冰上，备用抽提DNA。按照CTAB方法提取DNA，各研究材料的DNA的含量在Bio—Photometer分光光度计(Eppendorf公司)中检查测定。
(2)所用试剂:
① 2XCTAB
CTAB2g
0.5M EDTA (PH8.0) 8mL IM Tris-Hcl (PH8.0)20mL
Nacl12.3g
加 ddH20 至200mL
(2)10% CTAB` CTAB100g
Nacl40.95g
加 ddH20 至1000mL
(3)CTAB法提取DNA的原理和步骤:
1)将种子在37°C恒温培养箱中萌发后置于25°C温室中生长，当植株长出3-4片叶时，取约3g新鲜叶片，加液氮研磨成粉末状，分别置于1.5mL的离心管中；
2)加入800μ I的CTAB提取缓冲液，混匀(CTAB在65°C水浴预热)，每5min轻轻震荡几次，20min 后 12000 r/min,离心 15 min ；
3)小心吸取上清液，加入等体积的酚:氯仿(各400μ I)溶液，混匀，4°C，12000 r/min,离心10 min ；
4)小心吸取上清液,加入等体积的氯仿,混匀，4°C,12000 r/min,离心10 min。
[0006]5)重复步骤(4) 1-2次，至蛋白层不出现为止；
6)取上清，-20°C沉淀lh, 4°C, 12000 r/min,离心 10 min ；
7)弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
8)室温下干燥后(一般干燥5-15 min)，溶于30-50 μ I DEPC去离子水中，于_20°C或者-70°C下保存备用。
[0007]2、PCR反应程序
(I)引物来源
本研究所用引物均来自于自身设计的引物，由英骏生物技术有限公司合成。[0008](2) PCR反应体系
本研究所用反应体系均采用2 X GC、总体积20 μ I进行配置，具体如下:
【权利要求】
1.根据各对引物在(日本晴)染色体上的具体位置等相关信息，构建了水稻第I染色体的InDel分子标记的物理图谱，该图谱包括86对InDel分子标记，平均每IcM分布0.47对标记，平均每对引 物的物理间隔为0.52Mb。
【文档编号】C12Q1/68GK103725768SQ201210388285
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月15日 优先权日:2012年10月15日
【发明者】不公告发明人 申请人:丁筱玲