专利名称：高效RNA逆转录合成cDNA的方法
技术领域：
本发明涉及RNA逆转录反应，尤其是涉及一种以RNA或mRNA为模板，高效RNA逆转录合成cDNA的方法。
背景技术：
在有互补的寡核苷酸引物的存在下，各种RNA依赖的DNA聚合酶可利用RNA作为模板，合成 cDNA (Karkas，JD，PROC。NATL ACAD。美国 70:3834-3838，1973)，这种反应被称之为逆转录。通常来讲，使用逆转录酶，如来自鸟类成髓细胞瘤病毒(AMV)或莫洛尼氏鼠白 血病病毒(MMLV)的逆转录酶(鲍威尔，LM等，细胞50:831-840，1987)，cDNA的合成率是比较低下的。使用耐热(大于50°C )的DNA依赖的DNA聚合酶，(Myers, T. ff. and Gelfand,
D.H. Biochemistry 30:7661-7666，1991 和 U.S. Pat. Nos. 5,322,770; 5,310,652;and 5, 407, 800)作为逆转录酶用于cDNA合成，可以提高cDNA的合成量，但仍不能达到令人满意的效果。而从微量RNA或mRNA含量的样本提取靶核酸，进行cDNA合成时，高产量的cDNA的合成对后续实验攸关重要，比如血清HCV RNA病毒检测。美国专利777946和8071311公开了利用一种由5’ RNA部分和3’的DNA部分组成的复合引物进行常温DNA扩增方法。其中的复合引物在合成cDNA后，其5’RNA部分可被核糖核酸酶H酶(RNAH)降解掉，暴露出互补的3’单链末端，使后续的引物有机会结合在同一模板上，形成下一次扩增循环，使DNA扩增量提高。但是这种反应比较复杂，需要多种酶参与反应。因此，采用一种更简单的方法来增加cDNA的扩增量对于微量RNA模板的样品来讲尤其重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效RNA逆转录合成cDNA的方法。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明所述的高效RNA逆转录合成cDNA的方法，它是以正链RNA或mRNA为模板，使用逆转录引物，在逆转录酶的作用下进行cDNA的合成；其中
所选逆转录模板的目标区段的3’端依次称为特异性引物结合区R1、间隔区S和部分模板片段区R2 ；
所用的逆转录复合序列引物由分别含有模板负链序列和正链序列的两段脱氧核苷酸片段组合而成其中逆转录引物的3’端的Pl区是一组和模板特异性引物结合区Rl相互补的特异性脱氧核苷酸序列，逆转录引物的5’端的P2区是一组和部分模板片段区R2序列相同的特异性脱氧核苷酸序列。所述和模板特异性引物结合区Rl相互补的逆转录引物的3’端的Pl区的脱氧核苷酸序列长度为15-24bp。所述和部分模板片段区R2序列相同的逆转录引物的5’端的P2区的脱氧核苷酸序列长度为12-18 bp。
所述逆转录模板的特异性引物结合区R1、部分模板片段区R2之间的间隔区S的序列长度与逆转录引物Pl区的序列长度相等或加/减Ibp时，即S长度=Pl长度或S长度=Pl长度±lbp时，逆转录合成cDNA的合成量更高。本发明的优点在于逆转录反应简单、高效，大大提高了 cDNA的合成量，进而使后续PCR的扩增量大大提高。本发明中的RNA或mRNA包括来自微生物(如病毒、细菌、衣原体和真菌等)、人和动植物等细胞。本发明所述的逆转录初始反应中，逆转录引物的Pl区段和模板RNA结合，在逆转录酶的作用下，合成和RNA互补的第一条cDNA链，由于逆转录引物的P2区含有可以和部分新合成的cDNA链互补的序列，在一定程度上可以随机在新的cDNA链的5’端形成一个发夹状结构，使得模板RNA上的引物Pl区段所结合区域重新暴露出来，新的引物再结合其上，开设新一轮的cDNA合成。这样重复进行，形成一个在RNA模板上产生多个cDNA拷贝的逆转·录反应。
图I是本发明的反应模式图。图2是实施例I的逆转录引物设计图。图3是实施例I的实验结果图。图4是实施例2的逆转录引物设计图。图5是实施例2的实时荧光PCR检测HAV及参照品反应图。图6是实施例2的实时荧光PCR检测HAV参照品反应图。图7是实施例2的逆转录引物设计对比实验结果图。
具体实施例方式本发明高效RNA逆转录合成cDNA的方法，它是以正链RNA或mRNA为模板，使用特殊设计的特异性逆转录引物，在逆转录酶的作用下进行cDNA的合成；其中
所选逆转录模板的目标区段的3’端依次称为特异性引物结合区R1、间隔区S和部分模板片段区R2 ；
主导cDNA合成反应的酶是RNA逆转录酶(Reverse transcripatase),也可以是RNA为模板的DNA聚合酶。本发明设计的特异性逆转录引物是由分别含有模板RNA负链序列和正链序列的两段脱氧核苷酸片段组合而成的复合序列引物其中该逆转录引物的3’端的Pl区是一组和模板RNA的特异性引物结合区Rl相互补的特异性脱氧核苷酸序列，逆转录引物的5’端的P2区是一组和部分模板RNA片段区R2序列相同的特异性脱氧核苷酸序列。逆转录反应缓冲液包括dNTPs，250mMTris-HCl pH8. 3 ；375mM KCl ；15mM MgCl2 ；50mM DTT，等。逆转录反应试剂应顺序加入，反应应在37-42°C进行，合成反应应在30_60分钟内完成。和模板特异性引物结合区Rl相互补的逆转录引物的3’端的Pl区的脱氧核苷酸序列长度为15-24bp。和部分模板片段区R2序列相同的逆转录引物的5’端的P2区的脱氧核苷酸序列长度为12-18 bp ;逆转录模板的特异性引物结合区R1、部分模板片段区R2之间的间隔区S的序列长度与逆转录引物Pl区的序列长度相等或加/减lbp。如图I所示，在在本发明的逆转录反应中，引物的Pl区段和模板RNA结合，合成和RNA互补的第一条cDNA链，其包括了可和引物P2区段互补结合的对应区段。通过引物P2区和新合成的cDNA链含有的P2互补序列区段的随机结合，在cDNA链的5’端可形成发夹式结构，导致模 板RNA的Rl区恢复到单链状态，新的引物Pl区段得以再次结合于同一模板RNA的Rl区，在逆转录酶的作用下，启动新的cDNA链的合成。即在和其它逆转录反应相同的条件下，使用本发明特殊设计的逆转录引物，可以使用同一 RNA模板，连续重复合成多个cDNA链，使cDNA合成量提高数倍，实现了高效合成单链cDNA的逆转录反应。实施例I :
如图2所示，采用HCV病毒RNA用于cDNA合成的目标模板RNA，逆转录复合序列弓I物为5MCT化Γ7似以6KGTGCACGGTCTACGAGACCTC，特异性引物的3’端有和模板RNA相互补的特异性脱氧核苷酸序列(Pl)，19bp，可结合于模版RNA的Rl区。特异性引物的5’端有可和模版RNA序列R2区域相同的特异性脱氧核苷酸序列(P2)，14bp。在图2中显示RNA模板的Rl和R2区间相隔S区长度为Pl序列长度加lbp，即20bp。使用常规逆转录引物5’ TGCACGGTCTACGAGACCTC作为对比反应。逆转录反应设置
反应配置的逆转录反应混合物包括I微克的HCV RNA模板，dNTPs (dATP，dCTP，dGTP和 dTTP)，50 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25。C)，75 mM KCl, 3 mM MgC12, 10 mM DTT和5单位的逆转录酶。反应混合物分为两组，一组(A管)使用“常规逆转录引物”，另一组(B管)使用本发明所述的“逆转录复合序列引物”。I. RNA /引物混合物反应管A管和B管 A管HCV RNA I微克
20 uM常规逆转录引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H20 至IOul
B管HCV RNA I微克 20 uM逆转录复合序列引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H20 至IOul
2.孵育A，B管样品65°C 5分钟，冰浴I分钟。3.再在每个反应中加入
5X逆转录溶液4ul，
逆转录酶(5U/ul)lul,
DEPC H2O5 ul
25°C 10 分钟，42°C 50 分钟，70°C 10 分钟。按照上述步骤，两组反应同时进行cDNA合成的逆转录反应，得到的逆转录cDNA产物放-20°C保存。
逆转录反应完成后，分别取等量的逆转录cDNA产物为模板，进行平行样品的PCR扩增。扩增结束后，取5ul PCR产物，采用电泳方法测定。以电泳条带的强弱来比对各个反应管产物的量的差别。结果见图3，PCR产物应为380bp。样品1，2，5，和6为使用常规逆转录引物的逆转录cDNA模板的PCR结果。样品3，4，7，和8为使用逆转录复合序列引物的逆转录cDNA模板的PCR结果。电泳凝胶上的带型表明，在其它逆转录和PCR反应的各个条件相同的情况下，使用本发明的逆转录复合序列引物可以提高cDNA合成量，进而使PCR扩增大大提高。实施例2
采用HAV RNA为cDNA合成的目标模板RNA，使用本发明所述的特异性逆转录复合引物和常规逆转录引物首先进行逆转录反应，合成目标cDNA。采用实时荧光PCR技术进行PCR扩增，对比两种引物的逆转录效果。如图4所示，逆转录复合序列引物为RT-I 5’ aggaggtttggattctCCatttcaagagtccacaca,特异性引物的3’端有和模板RNA相互补的特异性脱氧核苷酸序列(Pl)，20bp，可结合于模版RNA的Rl区。特异性引物的5’端有可和模版RNA 序列R2区域相同的特异性脱氧核苷酸序列(P2)，16bp。在图4中显示RNA模板的Rl和R2区间相隔S区长度为19bp。使用常规逆转录引物RT-2 5’ CCatttcaagagtccacaca作为对比反应。逆转录反应设置(同实施例I)。反应配置的逆转录反应混合物包括I微克的HAV RNA模板，dNTPs (dATP, dCTP，dGTP 和 dTTP)，50 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25° C)，75 mM KCl, 3 mM MgC12, 10 mMDTT和5单位的逆转录酶。反应混合物分为两组，一组(A管)使用“常规逆转录引物，，,另一组(B管)使用本发明所述的“逆转录复合序列引物”。逆转录反应设置如下
1.RNA /引物混合物反应管A和B管
A管HAV RNA I微克
20 uM常规逆转录引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H2O 至IOul
B管HAV RNA I微克 20 uM逆转录复合序列引物Iul
10 mM的dNTP混合物Iul
DEPC H20 至IOul
2.孵育A，B管样品65°C5分钟，冰浴I分钟。3.再在每个反应中加入
5X逆转录溶液4ul，
逆转录酶(5U/ul)lul,
DEPC H2O5 ul
25°C 10 分钟，42°C 50 分钟，70°C 10 分钟。按照上述步骤，两组反应同时进行cDNA合成的逆转录反应。得到的逆转录cDNA产物放-20°C保存。逆转录反应完成后，分别取等量的逆转录cDNA产物为模板，使用Bio-Rad SYBR Green Supermix (2X)实时荧光反应试剂进行PCR扩增。
PCR扩增反应引物为
HAV-F 5’ acagattctacatttggattggtHAV-R 5’ aacttcattattteatgetcct实时荧光反应设置(反应为双管平行设置)
A管HAV常规逆转录引物cDNA I ul
HAV-FO. 5 ul
HAV-RO. 5 ul
DEPC H2O 至13 ul
2X Bio-Rad SYBR Green Supermix 15 ul B管HAV复合逆转录引物cDNAIul
HAV-FO. 5 ul
HAV-RO. 5 ul
DEPC H2O 至13 ul
2X Bio-Rad SYBR Green Supermix 15 ul PCR 扩增程序为94°C 2 分钟，94°C 30 秒，54°C 30 秒，72 °C 30 秒 X40 循环。“标准曲线”使用已知HAV cDNA以10倍稀释至7个稀释度作为反应参照品。结果如图5-图7所示使用常规逆转录引物的cDNA为模板的实时荧光PCR反应的Ct值为27。使用复合逆转录引物的cDNA为模板的实时荧光PCR反应的Ct值为23。结果表明，在其它逆转录和PCR反应的各个条件相同的情况下，使用逆转录复合序列引物可以提高cDNA合成量，进而使PCR扩增大大提高。
权利要求
1.一种高效RNA逆转录合成CDNA的方法，它是以正链RNA或mRNA为模板，使用逆转录引物，在逆转录酶的作用下进行cDNA的合成；其特征在于 所选逆转录模板的目标区段的3’端依次称为特异性引物结合区R1、间隔区S和部分模板片段区R2 ； 所用的逆转录引物由分别含有模板负链序列和正链序列的两段脱氧核苷酸片段组合而成的复合序列引物其中逆转录引物3’端的Pl区是一组和模板特异性引物结合区Rl相互补的特异性脱氧核苷酸序列，逆转录引物的5’端的P2区是一组和部分模板片段区R2序列相同的特异性脱氧核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的高效RNA逆转录合成cDNA的方法，其特征在于所述和模板特异性引物结合区Rl相互补的逆转录引物的3’端的Pl区的脱氧核苷酸序列长度为15-24bp。
3.根据权利要求I所述的高效RNA逆转录合成cDNA的方法，其特征在于所述和部分模板片段区R2序列相同的逆转录引物的5’端的P2区的脱氧核苷酸序列长度为12-18 bp。
4.根据权利要求I所述的高效RNA逆转录合成cDNA的方法，其特征在于所述逆转录模板的特异性引物结合区R1、部分模板片段区R2之间的间隔区S的序列长度与逆转录引物Pl区的序列长度相等或加/减lbp。
全文摘要
本发明公开了一种高效RNA逆转录合成cDNA的方法，它是以正链RNA或mRNA为模板，使用逆转录引物，在逆转录酶的作用下进行cDNA的合成；其中所选逆转录模板的目标区段的3’端依次称为特异性引物结合区R1、间隔区S和部分模板片段区R2；所用的逆转录复合序列引物由分别含有模板负链序列和正链序列的两段脱氧核苷酸片段组合而成其中逆转录引物的3’端的P1区是一组和模板特异性引物结合区R1相互补的特异性脱氧核苷酸序列，逆转录引物的5’端的P2区是一组和部分模板片段区R2序列相同的特异性脱氧核苷酸序列。
文档编号C12P19/34GK102943100SQ20121047899
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者白宪鹤, 付光宇, 李桂林, 高利飞, 张岚, 马建军, 吴学炜, 苗拥军 申请人:郑州安图绿科生物工程有限公司