专利名称：双峰驼血型糖蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼血型糖蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术：
血型糖蛋白(glycophorin )又称涎糖蛋白(sialo glycoprotein),因它富含唾液酸。是红血球细胞膜上的一种含量丰富的穿膜糖蛋白。血型糖蛋白是第一个被测定氨基酸序列的蛋白质，有几种类型，包括A、B、C、D。血型糖蛋白B、C、D在红细胞膜中浓度较低。 血型糖蛋白A是一种单次跨膜糖蛋白，由131个氨基酸组成，是MN血型抗原，也是流感病毒和疟原虫入侵红血球的受体。其亲水的氨基端露在膜的外侧，结合16个低聚糖侧链。血型糖蛋白的基本功能可能是在于它的唾液酸中含有大量负电荷，防止了红细胞在循环过程中经过狭小血管时相互聚集沉积在血管中。
研究发现，血型糖蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质并与医学有着重要的关系。主要存在于细胞膜上，是典型的膜固有蛋白。血型糖蛋白二聚体是其在膜上存在的生理形式。血型糖蛋白不仅自身形成二聚体或多聚体，也与带3蛋白形成复合物。流感病毒、仙台病毒及抗血型糖蛋白抗体与血型糖蛋白特异性结合，可降低带3蛋白的旋光流动性，也影响血型糖蛋白-带3蛋白复合物在膜上的分布。血型糖蛋白与细胞骨架蛋白也有一定的关系。在医学上，血型糖蛋白异常会引起血型变异。血型糖蛋白作为凝集素受体、病毒受体、支原体受体、毒素受体等应用于医学界。血型糖蛋白的疏水部分可使红细胞膜对 K+、水的通透性改变，完整的血型糖蛋白可增加人工黑脂膜的导电性，也能促进磷脂等穿过细胞膜。血型糖蛋白在体外能增强红细胞生成素对血红素合成的促进作用。
血型糖蛋白的研究，1978年，Gahmberg等人用血型糖蛋白的抗血清和葡萄球菌A 蛋白等对骨髓红细胞作玫瑰花形成实验，结果表明只有红系统的骨髓细胞才能表达血型糖蛋白，而原始红细胞几乎不含血型糖蛋白。1982年，Jokinen等人提出，骨髓 分化的红细胞先在核糖体上合成血型糖蛋白前体物质。1990年,Lampio等人对血型糖蛋白A对半乳糖氧化酶红细胞糖苷脂氧化的影响作了研究。2005年，Hajime Mizukami等人对血型糖蛋白 A基因MN血型的等位基因作了系统分类。
在双峰驼中，血型糖蛋白是骆驼红细胞膜上重要的糖蛋白，具有血型活性，又是多种物质及生物的受体，与生物医学有着密切的关系。发明内容
本发明提供了一种双峰驼血型糖蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，血型糖蛋白是红血球细胞膜上的一种含量丰富的穿膜糖蛋白，通过利用该双峰驼血型糖蛋白的基因编码序列构建系统发生树，可以直观的表现出双峰驼血型糖蛋白序列与其他物种血型糖蛋白序列的差异，对研究血型糖蛋白在体外增强红细胞生成素对血红素合成的促进作用提供一定的理论依据。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼血型糖蛋白基因， 该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中64-501位的序列。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种双峰驼血型糖蛋白基因的重组蛋白。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进上述重组蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。
上述组蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼血型糖蛋白中得到双·峰驼血型糖蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼血型糖蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。
本发明双峰驼血型糖蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，是骆驼红细胞膜上重要的糖蛋白，具有血型活性，又是多种物质及生物的受体，与生物医学有着密切的关系，并且，血型糖蛋白在体外能增强红细胞生成素对血红素合成的促进作用。因此，对骆驼血型糖蛋白的研究将有助于细胞生物学和医学的发展。
附图1为双峰驼血型糖蛋白基因RT-PCR产物电泳图。
附图2为构建系统发生树所用血型糖蛋白氨基酸同源性比较。
附图3为不同物种血型糖蛋白氨基酸序列系统进化树。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
下面结合实施例对本发明作进一步论述实施例1，一种双峰骑血型糖蛋白基因，该基因的核昔酸序列具有SEQ ID NO.1所不的序列。本发明中的双峰驼血型糖蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的血型糖蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的新基因序列，获得的双峰驼血型糖蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。
可根据实际需要，对上述双峰驼血型糖蛋白基因作进一步优化或/和改进基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中64-501位的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR 产物长度为563bp，电泳结果见附图1，其中64-66位为起始密码子ATG，499-501位为终止密码子TGA，64-501位为编码蛋白质区域(⑶S)。
实施例2，一种双峰驼血型糖蛋白基因的重组蛋白。
可根据实际需要，对上述双峰驼血型糖蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO. 2所示的序列。将双峰驼血型糖蛋白基因cDNA 序列中的编码序列(OTS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见SEQ ID NO. 2。
重组蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多 肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
通过设计一对引物从双峰驼血型糖蛋白中得到双峰驼血型糖蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；实施例3，一种双峰驼血型糖蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步，总RNA提取1、组织分离(Isolation)从内蒙古阿拉善盟双峰驼，快速采得样品，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于一 70°C 保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
2、总 RNA 的分离(Total RNA isolation)(I)、提取RNA的准备工作玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C 烘烤4小时。
匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. 1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5%的SDS处理。
Tip头、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。
(2 )、组织总RNA提取取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL, USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟。吸取上清液，15_30°C温育5分钟。 加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒。15-30°C温育2_3分钟。4°C 12000g离心15分钟。吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗涤RNA，4°C 7500g离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。
(3)、组织总RNA的鉴定通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入I X TBE待用。琼脂糖凝胶用IXTBE配制。在IOul上样缓冲液(2XTBE，13% 菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2 — 3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。
第二步，引物设计及合成根据GenBanK发表的人(AAA52625.1)、鼠(EDK97062.1)等物种的血型糖蛋白基因mRNA 序列ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼血型糖蛋白cDNA为模版的PCR扩增， 以获得双峰马它血型糖蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5. O自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3 (正向^PSEQ ID NO:4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT 第三步，RT-PCR扩增按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成IOul 2XBc a 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, lul dNTP Mixture, 0. 5ul Rnase Inhibitor (40U/ul),lul BcaBEST Polymerase(22U/ul),lul Oligo dT Primer, lul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,总体系为 20 ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR 扩增条件97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分钟，如此进行30次循环； 72°C延伸10分钟，4°C保存。
第四步，蛋白基因的克隆1、PCR扩增片段的回收片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg琼脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg 离心I分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液， 静置I分钟后，IOOOOg离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
2、回收片段同T载体的连接连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下在 EP 管中制备下列连接反应液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA 20_40ng， Solution I 5ul，加dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。
3、质粒的转化从一70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。 加400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取IOOul铺于LB平板上，平板含0. 1%(V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒温培养10-15小时。
4、转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模板。用获得该片段的PCR条件进行扩增。PCR产物同Marker—起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入O. 1%(V/V)的青霉素钠(lOOmg/ ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。
5、质粒的回收质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下 将转化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2 液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟。将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟.EP管中液体即为回收的质粒。
6、质粒的酶切鉴定为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定.本研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I 和Hin d II1.保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul, Hin d III lul, 10XK Buffer 2ul, DNA ( lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时。琼脂糖凝胶电泳检测. 实施例4，重组质粒的测序取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
实施例5，双峰驼血型糖蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建1、双峰驼血型糖蛋白基因编码序列同源性比较在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等六种动物的血型糖蛋白基因编码蛋白序列，将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较(见附图2)。比较结果显示SEQ ID NO. 2序列与牛的血型糖蛋白氨基酸序列同源性为88. 00%ο
2、血型糖蛋白基因编码序列系统发生树构建在GenBank上搜索并获得人、鼠、牛等六种物种的6条血型糖蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树 (见附图3)。结果显示双峰驼血型糖蛋白基因同牛的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼血型糖蛋白基因。
序列表<110>新疆旺源驼奶实业有限公司〈120〉双峰驼血型糖蛋白的蛋白编码序列〈160〉 4〈210〉 I〈211〉 56权利要求
1.一种双峰驼血型糖蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的双峰驼血型糖蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中64-501位的序列。
3.一种含有权利要求1或2所述的双峰驼血型糖蛋白基因的重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQID NO. 2所示的序列。
5.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼血型糖蛋白中得到双峰驼血型糖蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT。
7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼血型糖蛋白中得到双峰驼血型糖蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT。
8.一种根据权利要求1或2所述的双峰驼血型糖蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 :5’ - ATGAACAGCATCTTGACTGCC-3’反引物，SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼血型糖蛋白及其编码序列，该蛋白编码序列的核苷酸序列具有SEQIDNO.1中从核苷酸第64-501位的核苷酸序列，该蛋白的多肽的氨基酸序列具有SEQIDNO:2所示的序列。本发明双峰驼血型糖蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，是骆驼红细胞膜上重要的糖蛋白，具有血型活性，又是多种物质及生物的受体，与生物医学有着密切的关系，因此，对骆驼血型糖蛋白的研究将有助于细胞生物学和医学的发展。
文档编号C12N15/12GK103014004SQ20121047825
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司