专利名称：双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼PPAR Y蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术：
过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proIiferatorac-tivated receptor, PPAR)因为能够使小鼠受到异种刺激后引起肝脏过氧化物酶体降低而被命名， 是一种核受体，同时本身也是配体激活转录因子，属于激素核受体家族。能够被一些降脂药物和脂肪酸类物质激活，与配体结合后被激活，然后与视黄醇类受体形成二聚体，再与所调节基因上游的过氧化物酶体增物反应元件(peroxiome proliferator respon-civa alamant, PPRE)结合而发挥转录调节作用，激活某些与脂肪代谢相关的蛋白或酶基因， PPARs调控多种在脂类代谢不同途径的基因，包括脂肪酸转运、细胞吸收、细胞内结合以及分解(β氧化和ω氧化)和储存；参与脂肪细胞的生成和转化；不仅能促进前脂肪细胞的分化，而且也能促进非脂肪细胞系细胞分化成脂肪细胞，促进脂肪沉积。PPAR基因在不同物种中存在α，β和Υ 3种亚型，它们由不同的基因编码，结构、功能及在不同组织的表达量都有较大差异，其中对脂肪代谢有影响的主要是PPARa和PPAR Y。
PPARy协同C/EBP (CCAAT)转录因子影响脂肪酸在脂肪组织中的贮存，能诱导脂肪前体细胞成熟为脂肪细胞，是脂肪细胞分化的一部分。并且，大多数PPARy目的基因直接参与脂肪合成途径。PPARy可以激活脂肪酸转运蛋白和脂肪酸转运酶，完成脂肪酸向肝脏的转运；PPARy能上调长链脂肪酸基因的表达，形成酯酰辅酶A15PPARy诱导小脂肪细胞的形成，调控脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)、脂肪型脂肪酸结合蛋白(adlipocyte fatty acid-binding proteins, A-FABP)、乙酸辅酶 A 合成酶(acetyl coenzyme A synzyme, ACAS)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FAS)与脂肪酸转运蛋白(fatty acid transport protein, FATP)等的表达,抑制瘦素(Ieptin)的表达，能防止高脂饮食诱导的肥胖。PPARy在脂肪、肌肉、肝脏等多种与胰岛素作用有关的组织中表达，激活后可调控与葡萄糖的产生、转运、利用及脂肪代谢的调节相关的基因的表达。在人PPARy基因多态性研究方面，发现了 Prol2Ala多态位点，血清载脂蛋白B在不同基因型个体间差异显著，该位点得到了广泛的研究，认为其与脂肪代谢异常、增强胰岛素敏感性及降低糖尿病的发生密切相关。
PPARy在脂肪酸代谢中有着关键的调控作用，因此，通过对PPAR Y从基因、蛋白质、酶活性和抑制剂等多方面的研究，必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望。
双峰驼有较强的耐旱和沉积脂肪能力，尤其是在水草充足的季节，驼峰能在短时间内沉积大量脂肪，很适合进行脂类代谢研究。发明内容
本发明提供了一种双峰驼PPARy蛋白基因，该基因是一种影响脂肪酸在脂肪组织中的贮存和转运，能诱导脂肪前体细胞成熟为脂肪细胞，并且直接参与脂肪合成途径，与机体组织对糖的利用、胰岛素敏感性、脂质合成和能量平衡等密切相关的基因，其核苷酸序列与马的PPAR Y蛋白核酸序列XM_001499929. 2具有95%的相似性。
本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼PPAR Y蛋白基因， 该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、猪PPAR Y 基因编码蛋白序列同源性为95. 00%，编码氨基酸序列同源性为86. 00%。
本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种双峰驼PPAR Y蛋白基因的重组蛋白。
下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进上述重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
上述重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、 或其活性片段、或其活性衍生物。
上述重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼PPAR Y蛋白中得到双峰驼PPARy蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼PPARy蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步，组织分离(Isolation);第二步，总RNA的分离 (Total RNA isolation),总 RNA 的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA 的准备工作、 组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步,全长cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全长cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCI^r 增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向WPSEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
本发明双峰驼PPAR Y蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它不仅在糖代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用，因此，通过对PPAR Y从基因、蛋白质、酶活性和抑制剂等多方面的研究，必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，因此本发明具有很大的应用价值。
附图1为本发明双峰驼PPAR Y蛋白基因RT-PCR产物电泳图。
附图2为为双峰驼和牛、人、鼠、猪等14种动物用Clustal X中对齐的PPARy蛋白氨基酸序列同源性比较结果图。
附图3为本发明双峰驼PPARy蛋白氨基酸序列和牛、人、鼠、猪等14种动物 PPARy蛋白氨基酸序列构建的系统进化树图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例1 :一种双峰驼PPAR Y蛋白基因，该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第 33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、猪PPARy基因编码蛋白序列同源性为95. 00%，编码氨基酸序列同源性为86. 00%。
实施例2 :—种双峰驼PPAR Y蛋白基因的重组蛋白。
实施例3 :重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
实施例4 :重组蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
实施例5 :重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
实施例6 :重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼PPAR Y蛋白中得到双峰驼PPAR Y 蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
实施例7 :—种双峰驼PPAR Y蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行第一步， 组织分离(Isolation);第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation),总RNA的分离 (Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴 定；第三步，全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
双峰驼PPAR Y蛋白基因cDNA序列的克隆1.组织分离(Isolation)从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于-70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA。
2.总 RNA 的分离(Total RNA isolation)(I)提取RNA的准备工作玻璃制品用0. lmol/L的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2 遍，180°C烘烤4小时。
匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20分钟至30分钟，再用0. 1%的DEPC水冲洗.由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5%的SDS处理。
Tip头、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。
双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。
(2)组织总RNA提取取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL, USA)的匀浆器管中匀浆。4°C、12000g离心10分钟；吸取上清液，15°C至30°C温育5 分钟；加O. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15°C至30°C温育2分钟至3分钟； 4°C、12000g离心15分钟，吸取上清液，加O. 8ml异丙醇，混合均匀；15°C至30°C温育10分钟，4°C、12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA ;倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗涤RNA，40C 7500g离心10分钟；自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分装，-70°C保存。
(3)组织总RNA的鉴定通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4小时至5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入I XTBE待用；琼脂糖凝胶用IXTBE配制；在IOul上样缓冲液(2XTBE， 13%菲可，O. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2分钟至3分钟。点样于琼脂糖凝胶中电泳。
3.全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)(1)引物设计及合成根据 GenBanK 发表的牛(Accession No: AB106107.1) 、人(Accession No: AF159714.1)、鼠(Accession No: BC066868.1)等物种的 PPAR Y 蛋白基因 mRNA 序列 ORF侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼PPARy蛋白cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼PPARy蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向WPSEQ ID NO. 4 (反向)， 序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT(2)RT-PCR 扩增按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录；反转录反应液组成IOul 2 XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixtur, 0. 5ul Rnase Inhibitor (40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul), Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20，总体系为 20 ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5 分钟(15分钟至30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件 970C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分钟，如此进行30次循环；72°C延伸 10分钟，4°C保存。
(3)克隆和测序PCR扩增片段的回收片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中，按每IOOmg琼脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟；将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg离心I分钟，倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体；在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体， 离心I分钟；将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I分钟后，IOOOOg离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。
回收片段同T载体的连接连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下，在 EP 管中制备下列连接反应液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA 20_40ng， Solution I 5ul，加dH20至IOul ;将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。
质粒的转化从_70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶；IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟；42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟；力口 400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟；取IOOul铺于LB平板上，平板含O. 1%(V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml) ;37°C恒温培养10-15小时。
转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落；将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模板； 用获得该片段的PCR条件进行扩增；PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段；若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0. 1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37°C 过夜摇菌培养，用于质粒回收。
质粒的回收质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下将转化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀，细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心；在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮，加入250ulP2液， 温和摇匀，室温静置4分钟；加入350ulP3液，温和摇匀，离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体；在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体；在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体，离心I分钟；将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟， EP管中液体即为回收的质粒。
质粒的酶切鉴定为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定，本研究具体操作 如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和 Hin d III,保证目的片段中无这两种酶的切点；组成如下酶切反应体系Bam H I lul, Hin d III Iul，10XK Buffer 2ul, DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul，30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电泳检测。
重组质粒的测序取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。
双峰驼PPAR Y蛋白基因编码序列同源性比较和系统发生树构建1、双峰驼PPARy蛋白基因编码序列同源性比较在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠、猪等14种动物的PPAR Y蛋白基因编码蛋白序列， 将其同克隆测序获得的本发明获得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物学软件MEGA4上进行序列同源性比较见附图2。比较结果显示，其同牛、人、鼠、猪PPARy基因编码蛋白序列同源性为95. 00%，编码氨基酸序列同源性为86. 00%。
2, PPAR Y蛋白基因编码序列系统发生树构建在GenBank上搜索并获得牛、人、鼠等14种物种的14条PPAR Y蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树见附图3。结果显示，双峰驼PPARy蛋白基因同猪的亲缘关系最近；间接证明了所得到的序列确为双峰驼PPARy蛋白基因。
本发明在提供了双峰马它PPAR Y蛋白基因的cDNA序列和蛋白编码序列基础上；将牛、人、鼠、猪等不同物种PPAR Y蛋白基因的CDS序列和氨基酸序列进行同源性比较；对包括双峰驼在内的14个物种的14个PPAR Y蛋白基因的CDS序列构建了系统发生树。
本发明中的双峰驼PPARy蛋白基因的cDNA序列是通过以双峰驼肝脏组织中总 RNA为模板，参考牛、人、鼠等物种的PPAR Y蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR 而获得的新基因序列。获得的双峰驼PPAR Y蛋白基因cDNA序列见SEQ ID NO.1。将双峰驼PPAR Y蛋白基因cDNA序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的蛋白质编码序列见 SEQ ID NO. 2。
本发明在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为2283bp，电泳结果见附图1，其中 33-35位为起始密码子ATG，2274-2276位为终止密码子TAA，33-2276位为编码蛋白质区域 (⑶S)。在SEQ ID NO. 1，双峰驼PPARy蛋白基因编码747个氨基酸。双峰驼和猪、人、鼠、 牛等动物用Clustal X中对齐的PPAR Y蛋白基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。对包括SEQ ID NO.1在内的14个物种的14条PPAR Y蛋白基因的⑶S序列构建了系统发生树，结果发现双峰驼PPARy蛋白同猪和牛的进化距离最近，间接证明了所得到的序列确为双峰驼PPAR Y蛋白基因。
本发明参考其它物种PPAR Y基因序列，克隆测序获得双峰驼PPAR Y基因的cDNA 序列，并对不同物种PPAR Y基因的⑶S序列进行同源性比较，旨在了解和验证PPARy基因的结构特点，为今后研究PPAR Y基因与双峰驼脂类代谢 的关系提供基础资料。
以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
序列 表<110>新疆旺源驼奶实业有限公司〈120〉双峰驼PPAR Y蛋白的蛋白编码序列〈160〉 4〈210〉 I〈211〉 2128〈212〉 DNA〈213〉阿拉善盟双峰驼 〈400〉 Iaaacagcttg attggcgtca ttcaggagct ggatggcgtg ggacatgtgc aaccaggact60ctgtatggag tgacatcgag tgtgctgctc tggttggtga agaccagcct ctttgcccag120atcttcctga acttgacctt tctgaactag acgtgaacga cttggataca gacagctttc180tgggtggact caagtggtgc agtgaccaat cagaaatcat atccaatcag tacaacaatg240agccttcgaa catatttgag agcactggtg ggatctgggt attctttgcc ctgcaattgc300ggtctgctgc caacgagaag atagatgaag agaatgaggc aaacttgcta gcagtcctca360cagagacact ggacagtctc cctgtggatg aagacggatt gccctcattt gatgcactga420cagatggaga tgtgaccacc gagaatgagg ctagtccttc ctccatgcct gacgacaccc480ctccgcctca ggaggcagaa gagccgtccc taaccgagaa ttcatggagc aataaagcga540agagcatttg tcaacagcaaaagccacaaa gacgtccctg ctcggagctt ctcaagtatc600tgaccacaaa tgatgaccctcctcacacca aacccacaga gaccaggaac agcagcagag660acaaatgcac ctccagaaagaaggcccaca cacaagctca gtctcaccac ttacaagcca720aaccaacaac tttatctcttcctctgaccc cagagtcacc aaatgacccc aagggttccc780catttgagaa caagactattgaacgaacct taagtgtgga actctctgga actgcaggtc840taactccacc cacaactcctcctcataaag ccaaccaaga taaccctttt agggcttctc900caaagctgaa gccctcttgcaagactgtgg tacctccgcc atcaaagaag ccccggtaca960gtgagtcttc tggtacccaaggcaataacc ccaccaagaa agggccggag cagtcggagt1020tgtacgcaca gctcagcaagacctcagtgc tcaccagtgg acacgaggaa aggaaggcca1080ggcggcccag tctgcggctgtttggtgacc atgactattg tcagtcaatt aattccaaaa1140cggaaatact tattaacatatcacaggagc tccaagactc tagacaacta gaatacaaag1200atgcttcctc cgactggcaggggcagatgt gcccttccac agattcagac cagtgctacc1260tgagagagac ttcggaggcgagcaggcagg tctctcccgg cagcaccaga aaacagctcc1320aagaccagga aatccgagctgagctgaaca agcatttcgg ccatcccagt cgagctgttt1380ttgacgacga agcagacaagaccagtgaac tgagggacag tgatttcagt aatgaacaat1440tctccaaact acctatgtttataaattcag gactagccat ggatggcctg tttgatgaca1500gcgaagatga aagtgataaactgaactccc catgggatgg cgcgcaaccc tattcgttat1560ctggctacta ctatgaggcaggacactgca gacacccaac gcaccgaaat tctccgctgt1620gcgcaagatc acgttcaagatcaccctgca gccggcggcc caggtatgac agctacgagg1680agtatcagca cgagaggctgaagagggaag aataccgcaa agagtatgag aaacgggagt1740ctgaaagggc caaacaaagggagaggcaga ggcagaaggc aattgaagaa cgccgtgtga1800tttatgttgg taaaatcagacctgacacaa cacggacaga actgagggac cgttttgaag1860tttttggtga aattgaggagtgcacagtaa atctccggga tgatggagac agctatggtt1920tcattaccta ccgttatacctgtgatgctt ttgctgctgt tgaaaatgga tacactttgc1980gcaggtcgaa tgaaactgacttcgagctgt acttttgtgg acgcaagcaa tttttcaagt2040ctaactatgc agacctagattcaaactcag atgactttga ccctgcttcc accaagagca2100agtatgactc tctggatttcgatagtttac tgaaggaagc tcagagaagc ttgcgcaggc2160gactggtggt ccttgtgaccgagaagccag agaatacatt attagcgctc tgtcctcccc2220cgatttcaga tagtagtccccatgcccaac cgcttacact gcaagattca gcataaaaga2280cta2283 〈210〉 2 〈211〉 747 〈212〉 PRT 〈213〉阿拉善盟双峰驼 〈400〉 2MAWDMCNQDS VWSDIECAALVGEDQPLCPD LPELDLSELD VNDLDTDSFL GGLKWCSDQS60EIISNQYNNE PSNIi^STGGIWVFFALQLR SAANEKffiEE NE/W1A1T EHOSIPVDE120DGLPSFDALT DGDVTTENEASPSSMPDDIP PPQEAEEPSL IENSWSNKAK SIOQQQKPQR180RPCSELLKYL TTODPPfflKPIETRNSSRD KCTSRKKAHT QAQSHffijQAK FTTLSLPLIP240
权利要求
1.一种双峰驼PPARy蛋白基因，其特征在于该基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第 33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、猪PPARy基因编码蛋白序列同源性为95. 00%，编码氨基酸序列同源性为86. 00%。
2.一种根据权利要求1所述的双峰驼PPAR Y蛋白基因的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的核苷酸序列为SEQID NO.1。
4.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
6.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列为SEQID NO. 2。
7.根据权利要求2或3所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼 PPARy蛋白中得到双峰驼PPAR Y蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向) 和SEQ ID NO. 4 (反向),序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
8.根据权利要求4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼PPARy 蛋白中得到双峰驼PPARy蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
9.根据权利要求5或6所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼 PPARy蛋白中得到双峰驼PPAR Y蛋白基因，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向) 和SEQ ID NO. 4 (反向),序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
10.一种根据权利要求1所述的双峰驼PPAR Y蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行 第一步，组织分离(Isolation);第二步，总RNA的分离(Total RNA isolation),总RNA的分离(Total RNA isolation)包括提取RNA的准备工作、组织总RNA提取、组织总RNA的鉴定；第三步，全长 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全长cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物设计及合成、RT-PCR扩增、克隆和测序，该引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼PPARγ蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法；该基因具有SEQIDNO.1中从核苷酸第33-2276位的核苷酸序列。本发明双峰驼PPARγ蛋白是一种具有多种生物学功能的蛋白质，它不仅在糖代谢和脂肪酸代谢中有着关键的调控作用,因此,通过对PPARγ从基因、蛋白质、酶活性和抑制剂等多方面的研究,必然会为肥胖、胰岛素抵抗综合症、糖尿病等疾病的预防和治疗带来新的希望，因此本发明具有很大的应用价值。
文档编号C12N15/12GK103014002SQ20121047825
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司