专利名称：一种草鱼白细胞介素10基因和蛋白及其重组表达方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种草鱼白细胞介素10基因的重组表达和纯化技术。
背景技术：
白细胞介素10 (interleukin-10, IL-10)是一种重要的细胞因子。1989年Fiorentino等发现小鼠Th2细胞能分泌一种抑制Thl细胞分泌干扰素等细胞因子的物质，因此将这种物质命名为细胞因子分泌抑制因子(cytokine synthesis inhibitingfactor, CSIF)，后称为白细胞介素10。随后的研究发现，该细胞因子对炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病起重要作用。它能抑制T细胞、巨噬细胞的增值分化，同时也能促进B细胞的 稳定分化，它的免疫多样性使其在免疫系统中发挥着重要的作用。目前的研究还表明，白细胞介素10对于炎症性动物有免疫调节功能和可能的治疗作用。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，俗称有鲩、油鲩、草鲩、白鲩、草鱼、草根(东北)、混子、黑青鱼等。英文名=Grass carp。因其生长迅速，饲料来源广，是中国淡水养殖的四大家鱼之一，具有重要的经济价值。但草鱼抗病力和成活率较低，易患出血病、烂鳃病、赤皮病和肠炎病等，加之高密度养殖增加了水产动物之间病原体交叉感染的机会，使病害日益加剧。到目前为止，防止草鱼及水产动物疾病主要依靠药物，但经常使用药物防治疾病，病原体很可能对某些药物产生抗药性，致使防治失败，且药物在水中积累过多，极易污染水体，造成生态平衡破坏，而采取免疫学方法防治疾病则既可避免这种弊端，又提高产品质量。因此，从草鱼本身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和制定新的疾病防治措施，成为人们迫切需要解决的问题。由于白细胞介素-10在鱼类炎症反应中具有广泛生物学活性及其在免疫调控中的重要性，必将使其在草鱼病害防治中非常重要的作用。
发明内容
本发明的目的是为提供草鱼白细胞介素10蛋白的重组表达方法，为草鱼白细胞介素10蛋白的产业化应用提供可能。为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下草鱼白细胞介素10基因，其特征在于，该基因的碱基序列是序列表中的SEQ IDNo. I。基因编码的草鱼白细胞介素10蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列是序列表中的 SEQ ID No. 2。草鱼白细胞介素10基因的重组表达方法，其特征在于，利用同源克隆技术克隆得到草鱼白细胞介素10基因的CDNA全序列，利用草鱼白细胞介素10基因的成熟肽序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼白细胞介素10基因的重组表达系统，通过诱导表达和纯化从而获得有活性的重组草鱼白细胞介素10蛋白；其具体步骤为
步骤I基因克隆利用同源克隆技术从草鱼鳃组织中克隆得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA部分序列，再由RACE技术进一步得到草鱼白细胞介素10的cDNA全序列；步骤2重组表达载体的构建与筛选根据草鱼白细胞介素10基因的成熟肽序列，利用一对特异性引物rIL-10F 5’-AM MA GTT GAC TGC AAG TCT GA-3’和rIL-10R 5，_TTAGTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3’在成熟肽序列的两端引入BamHI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，将该成熟肽序列亚克隆到pET30a(+)表达载体上，完成原核表达载体的构建；将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行筛选鉴定后，将获得的阳性克隆作为工程菌株；步骤3重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化将筛选所得的工程菌株，以异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用镍离子亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得有活性的重组草鱼白细胞介素10蛋白。本发明的有益效果通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼白细胞介素 10，重组草鱼白细胞介素10可用于鱼类免疫机制的理论研究，也可用于制作饲料添加剂、疫苗的免疫增强剂以及病害防治药物以及其它医药产品。
图I是重组草鱼白细胞介素10的SDS-PAGE。图2草鱼IL-10重组蛋白活性鉴定结果。
具体实施例方式下面，结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本实施例中，一种草鱼白细胞介素10基因的重组表达方法，利用同源克隆技术克隆得到草鱼白细胞介素10基因的CDNA全序列，利用草鱼白细胞介素10的成熟肽的基因序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼白细胞介素10基因的重组表达体系，通过诱导表达和纯化从而获得具有活性的重组草鱼白细胞介素10蛋白；其具体步骤为步骤I基因克隆利用同源克隆技术从草鱼鳃组织中克隆得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA部分序列，再由RACE技术进一步得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA全序列；根据鱼类白细胞介素10基因同源比较的结果，从保守序列中设计简并引物IL-10F 5’ -ACT GAC TGT TGC TCA TTT GTG G-3’ 和 IL-1OR 5’ -TAC TGCTCG ATG TAC (C/T) TA AAG AG-3’。由草鱼鳃组织制备cDNA，从中克隆得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA部分序列。聚合酶链式反应简称PCR(英文全称Polymerase Chain Reaction),本步骤的PCR反应体系如下草鱼鳃组织cDNA0.3卟(微升)
10XPCR BufferI 叫(微升)
25 mM MgCL20.8 吣(微升)
IOmMdNTP0. 2叫(微升)
10 _ IL-10F0.2 (iL (微升)
10 _ IL-10R0.2 |iL (微升)
5U/nl Taq 酶0.1 叫(微升)加水补到总体积为10 i! L (微升)
本步骤的PCR 反应条件1 个循环94°C 3min ;35 个循环94°C 30sec,57°C 30sec, 72°C 30sec ；1个循环72°C lOmin，用I %琼脂糖凝胶对目标PCR产物进行电泳分析，溴化乙锭(EB)工作浓度溶液中染色5min，自来水中洗脱lmin，在凝胶成像系统中拍照，对目标片段进行胶回收。然后通过连接酶将回收的目的DNA片段与pGM-T载体连接，转化入大肠杆菌JM109感受态细胞，通过LB/Amp+平板进行筛选后，用基因特异性引物进行PCR进一步筛选阳性克隆，单克隆筛选的PCR条件如下94°C预变性5min，25个循环94°C变性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸30sec，然后最终延伸72°C IOmin0挑取阳性单克隆测序。根据草鱼白细胞介素10基因的cDNA部分序列设计巢式PCR引物，通过RACE技术进一步得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA全序列，RACE(rapid-amplification of cDNAends)技术是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，由于其为现有技术，因此不再详细描述。本步骤成功进行后，得到草鱼白细胞介素10基因，该基因的碱基序列是序列表中的 SEQ ID No. I。得到草鱼白细胞介素10基因后，并由该基因翻译得到草鱼白细胞介素10蛋白，该蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No. 2。步骤2重组表达载体的构建与筛选根据草鱼白细胞介素10的成熟肽的基因序列，利用一对特异性引物 rIL-10F 5’ -AAA AAA GTT GAC TGC AAG TCTGA-3’ 和 rIL-10R5，-TTA GTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3，。在成熟肽基因序列的两端引入BamHI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，将该成熟肽基因序列亚克隆到pET30a(+)表达载体上，完成原核表达载体的构建；将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，进行筛选鉴定后，将获得的阳性克隆作为工程菌株；在与其它鱼类和哺乳动物白细胞介素-10成熟肽的氨基酸序列相似性比较后，并通过SignalP 3.0软件，确定草鱼白细胞介素10成熟肽氨基酸序列(Lys23-His179)t5根据草鱼白细胞介素10成熟肽的cDNA基因序列，利用一对特异性引物rIL-10F(5’ -AAA AAAGTT GAC TGC AAG TCT GA-3，)和 rIL_10R(5，-TTA GTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3，)在成熟肽基因序列两端引入BamHI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，使用高保真聚合酶Phu进行PCR扩增获得具有限制性内切酶位点的草鱼白细胞介素10成熟肽基因序列，将PCR产物与表达载体pET30a(+)双酶切后，将草鱼白细胞介素10成熟肽基因序列连接到pET30a(+)上，完成原核系统表达载体的构建，pET30a(+)是购自Novagen公司的商品化原核表达载体，通过公共的商业途径获取。本步骤的PCR反应体系如下
草鱼头肾组织CDNA0. 3 ^iL (微升)
5 X PCR Buffer4 (iL (微升)
25 mM MgCL20.6 叫(微升)
10 mM dNTP0.4 叫(微升)
10 _ rIL-10F0.4 吣(微升)
IOioMrIL-IOR0. 4卟(微升)
5U/^1高保真酶0.4叫(微升)加水补到总体积为20 ii L本步骤的PCR反应条件1个循环98 V 30sec ；35个循环98 V IOsec,570C 30sec,72°C 20sec ；1 个循环72°C 10min，4°C保存。本步骤的限制性内切酶消化体系如下
DNA0.5 (ig
10 X EcoRI Buffer2 }iL
100 X BSA0.2 |aL
EcoRI ( NEB )0.5 (iL
XhoI (NEB)0.5 |iL加水补到总体积为25 ii L将上述限制性内切酶消化体系，于37°C孵育3小时。将PCR酶切产物和质粒酶切产物按摩尔比3 : I混合纯化后连接，连接产物转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中，分别以载体引物和基因特异性引物进行PCR双向筛选。筛选出的阳性克隆，并经序列测定鉴定后所作为工程菌株。步骤3 :重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化将筛选所得的工程菌株，以异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用含6XHis镍离子亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得有活性的重组草鱼白细胞介素10蛋白。
将筛选所得的阳性重组菌BL21 (DE3) /pET30a-gcIL_10单菌落，接种到LB培养基中，37°C振荡培养16h。然后按5%比例转接到新鲜LB培养基中，37°C继续培养至0D_值为0. 6 0. 8时，加入ImM IPTG在30°C诱导6h后，收集菌体，像菌体中加入IOmL缓冲液(20mmol/L Na2HPO4,0. 5moI/L NaCl, 20mmol/L 咪唑，lmg/mL 溶菌酶，pH = 7. 4)。超声波(200W,超声5秒，间隔10秒)破菌2分钟，4°C IOOOOrpm离心30分钟取上清。可溶性表达的目的蛋白可占菌体总目的蛋白的30 以上。从而完成诱导表达。按照上述的蛋白表达条件，扩大培养体积，诱导表达后收集菌体，破碎后离心收集上清，利用GE公司HisTrap HP柱进行亲和层析，用结合缓冲液(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH = 7.4)平衡，将裂解液以0. 45 y m滤膜过滤后引流到平衡好的柱中，上样完毕后用洗脱缓冲液A(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/L NaCl，50mmol/L咪唑，pH =
7.4)、洗脱缓冲液 B(20mmol/L Na2HPO4,0. 5mol/L NaCl, 500mmol/L 咪唑，pH = 7. 4)依次洗涤，收集洗脱峰组分。为进一步纯化并脱盐，利用GE公司Superdex 75进行纯化，以缓冲液(20mmol/L Na2HPO4, pH = 7. 4)洗脱，收集主峰，并经SDS-PAGE鉴定。从而完成蛋白质纯 化。如图I所示，图为重组草鱼白细胞介素10的SDS-PAGE。M为Mark, I为诱导表达后的工程菌总蛋白，2为纯化后的蛋白，由图片可知，经诱导表达后所得的工程菌株大量表达分子量为24KDa(千道尔顿)的重组蛋白，经纯化后得到高纯度的重组草鱼白细胞介素10蛋白(简称 rgcIL-10)。经过上述步骤，从而完成草鱼白细胞介素10蛋白的重组表达。进一步地，对获得的重组草鱼白细胞介素10蛋白进行活性鉴定。分离得到草鱼头肾淋巴细胞(HKL)，按6X IO5/孔接种到24孔板中(每个孔0. 3mL)，用含10 %小牛血清的RPMI 1640培养液于27°C，5% CO2浓度下培养过夜。然后，每孔再加入0. 3mLRPMI-1640(10%FBS，1%双抗生素)培养基，此时细胞处理分为四组20iig/mL LPS单独处理组；20 u g/mL LPS 和 2ng/mL rgcIL-10 联合处理组；20 u g/mL LPS 和 20ng/mL rgcIL-10联合处理组；20ii g/mL LPS和200ng/mL rgcIL-10联合处理组。因此其中LPS的终浓度为IOy g/mL,而rgcIL-10的终浓度分别为Ing/mL、10ng/mL和100ng/mL。同时，我们还将100°C加热五分钟后的rgcIL-10 (200ng/mL)作为蛋白活性的负对照，未加任何蛋白处理的组作为空白对照。上述6组细胞继续培养24小时后提取HKL总RNA，反转录后用实时定量荧光PCR检测促炎因子TNF-a以及抑炎因子TGF_P的mRNA的表达，此时的PCR体系为Real Master Mix(SYBR Green I) :9 y L ;5 倍稀释的 cDNA 模板10 y L ;上游引物 IOpmol/U L :0. 5iil ;下游引物 10pmol/u L 0. 5u L0 检测 TNF-a 和 TGF- ^ mRNA-的表达如图所示，由图可知LPS能够显著上调HKL中TNF-a mRNA的表达，但rgcIL-10能抑制这种反应，特别是加入lOOng/mL rgcIL-10后，LPS的作用被完全抑制。而当加入100°C加热失活后的rgcIL-10，不能抑制LPS所产生的影响。此外，rgcIL-10能显著上调TGF-P的mRNA表达。这些结果不仅验证了我们所获得的重组草鱼IL-10蛋白的活性，而且证明了在草鱼中IL-10具有抑制TNF-a但刺激TGF-P表达的重要功能(见附图2)。通过上述实施例获得的重组草鱼白细胞介素10蛋白具有以下应用前景I.重组草鱼白细胞介素10蛋白作为一种重要的抑炎因子，可将其发展为药物治疗草鱼出血病、肠炎等疾病引发的炎症反应。2.重组草鱼白细胞介素10蛋白用于鱼类免疫机制的研究。直接使用重组草鱼白细胞介素10蛋白或该蛋白制备的单克隆抗体或多克隆抗体，进行鱼类及其它动物免疫机制的研究。 本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明 的保护范围内。
权利要求
1.一种草鱼白细胞介素10基因,其特征在于该基因的喊基序列是序列表中的SEQ IDNo. I。
2.按照权利要求I所述序列翻译得到的草鱼白细胞介素10蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No. 2。
3.一种对权利要求I所述基因的重组表达方法，其特征在于，利用同源克隆技术克隆得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA全序列，利用草鱼白细胞介素10的成熟肽的基因序列构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达草鱼白细胞介素10基因的重组表达体系，通过诱导表达和纯化从而获得具有活性的重组草鱼白细胞介素10蛋白；其具体步骤为 步骤I基因克隆利用同源克隆技术从草鱼鳃组织中克隆得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA部分序列，再由RACE技术进一步得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA全序列； 步骤2重组表达载体的构建与筛选根据草鱼白细胞介素10的成熟肽的基因序列，利用一对特异性引物 rIL-10F 5，-AAA AAA GTT GAC TGC AAG TCTGA-3，和 rIL-10R 5，-TTAGTG CTT TTC TCT CTT TGA TG-3’在成熟肽基因序列的两端引入BamHI和XhoI两个不同的限制性内切酶位点，将该成熟肽基因序列亚克隆到pET30a(+)表达载体上，从而成功获得重组质粒；将构建得到的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行筛选鉴定后，将获得的阳性克隆作为工程菌株； 步骤3重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化将筛选所得的工程菌株，以异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为诱导剂进行诱导表达；诱导表达完成后，菌液经超声裂解并离心得到融合表达的裂解液，用镍离子亲和柱进行亲和层析，再以凝胶层析纯化，获得有活性的重组草鱼白细胞介素10蛋白。
全文摘要
本发明涉及草鱼白细胞介素10基因和蛋白及其重组表达方法。本发明提供了草鱼白细胞介素10基因序列和该序列编码的草鱼白细胞介素10蛋白序列，并提出草鱼白细胞介素10蛋白的原核重组表达方法，利用同源克隆技术得到草鱼白细胞介素10基因的cDNA全序列，利用草鱼白细胞介素10基因的成熟肽序列构建原核表达载体，筛选得到一种用于高效表达草鱼白细胞介素10基因的原核表达体系；其具体步骤为步骤1基因克隆；步骤2重组表达载体的构建；步骤3重组蛋白的表达及表达产物的分离纯化。本发明的有益效果通过本发明的技术方案可以工业化生产重组草鱼白细胞介素10，从而将其用于鱼类免疫机制的理论研究。
文档编号C07K14/54GK102747086SQ20111009602
公开日2012年10月24日 申请日期2011年4月18日 优先权日2011年4月18日
发明者周红, 汪新艳, 陈舜, 韦鹤 申请人:电子科技大学