专利名称：重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的纯化方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的纯化工艺，尤其涉及一种可大规模制备蛋白质类细胞因子受体拮抗剂的纯化工艺。
背景技术：
重组白细胞介素-1受体拮抗剂(rhIL-1ra)是存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-1受体，特异性地封闭IL-1的活性。1990年，美国Synergen公司的Eisenberg等人在英国Nature杂志首次报道了全长cDNA序列，(Nature 1990；343341-346)。
IL-1在机体的炎症反应中起着极为关键的启动作用。人类许多疾病的发生、发展过程中都有IL-1参与，IL-1本身不仅可以趋化体内的炎性反应细胞聚集至炎症发生部位，还可刺激体内的多种炎症介导介质的产生，而使炎症反应进一步加剧。因此，如何消除IL-1的影响将对治愈某些炎症疾病起着重要作用。IL-1ra是体内自然存在的IL-1拮抗剂。它可以特异地与细胞表面的IL-1受体结合而不激活靶细胞，从而阻断IL-1的生物学活性。IL-1ra是迄今为止发现的唯一细胞因子拮抗剂。
自从IL-1ra被发现以来，人们就试图将其开发为可供临床应用的药品，大量基础研究和初步临床研究结果显示IL-1ra对人类的许多炎性疾病确有疗效。此类报道更激起了人们对IL-1ra成为新药的企盼。90年代初期，Arend等成功地克隆出人IL-1ra cDNA，为使用基因重组手段大规模制备rhIL-1ra成为可能。近十年来，人类在对IL-1ra更为全面深入了解基础上，对IL-1ra的临床应用进行了全面开发。研究结果表明，rhIL-1ra将有可能用于治疗类风湿性关节炎、移植排异反应、移植物抗宿主反应、哮喘、牛皮癣等疾病。早在1996年，美国就开始了rhIL-1ra治疗类风湿性关节炎的临床研究。经过5年多的大规模、多中心、随机双盲、安慰剂对照的临床研究，结果表明，使用rhIL-1ra以75-150mg的剂量治疗6个月，类风湿性关节炎病人的临床症状和影象学征象均有明显改善。2001年报11月，美国FDA正式批准rhIL-1ra作为新药投入市场。
IL-1在其广阔地临床应用前，rhIL-1ra开发的一个主要障碍是它的临床应用剂量很大，治疗类风湿关节炎需要毫克的剂量，因而对生物技术下游工艺和生产有很高的要求，尤其是蛋白质的纯化方法。
分离和提纯蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对其他分子的生物学亲和力。方法主要包括透析和超(过)滤，密度梯度(区带)离心，凝胶过滤，等电点沉淀和pH控制，盐溶和盐析，有机溶剂分级法，电泳，及离子交换层析，凝胶过滤、选择吸附层析和亲和层析等。在蛋白质的纯化领域，一般认为必须利用蛋白质的不同理化特性，采用不同分离原理的分离纯化方法的组合，才能获得纯度较高的蛋白质。目前，已经投入生产的基因工程产品的纯化方法，多采用两种以上不同纯化方法组合的工艺路线。纯化过程复杂，工艺周期长，工艺要求条件高(一般需要在低温环境中进行)，产品回收率低。生产成本局高不下。
发明内容
基于目前的技术现状，本发明人经过长期摸索，提出了一种工艺简单，成本低廉，可大规模制备重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的纯化工艺。
本发明的方法主要为二步液相层析法，首先进行阴离子交换液相层析，然后再进行阳离子交换层析。令人惊讶的是，收集得到的OD280流出液的纯度、等电点、生物学活性完全符合药用标准。这样只使用简单的二步液相层析法就得到了高纯度高活性的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂。
本发明利用蛋白质的两性电离的特性，通过改变缓冲体系的pH值，使目标蛋白表面电荷发生改变，与层析介质的结合情况发生相应的变化，再利用不同的洗脱条件，达到分离纯化目标蛋白的目的。
根据本发明提供的纯化方法，在阳离子交换液相层析过程的层析介质优选为DEAE Fast Flow；使用的缓冲液包括A液pH 8.5 50mM Tris-HCl缓冲液，和B液pH6.8 20mM PB。上样完毕后，先以A液冲洗已载有目的蛋白的层析柱，然后采用B液进行梯度洗脱。B液的洗脱梯度可以为0％-80％。
在阳离子交换液相层析过程的层析介质优选为CM Fast Flow；使用的缓冲液包括A液pH 5.5 50mM HAc-NaAc缓冲液，和B液2M NaCl。同样，上样完毕后，先以A液冲洗已载有目的蛋白的层析柱，然后采用B液进行梯度洗脱。
根据本发明的纯化方法，二次层析过程的层析介质均可使用2M NaCl0.2N NaOH液进行再生。
用于本发明纯化的蛋白质可制备自任何本领域熟知的技术，主要包括菌种培养→菌体处理等方法。其中所用的菌种，可使用任何适当的宿主细胞表达多核苷酸，可提到的适当宿主的例子有原核细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；低等真核细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；植物细胞；高等真核细胞如哺乳动物细胞如CHO、COS细胞。哺乳动物表达系统的例子包括人细胞系，如Hela、293和U937细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。
考虑到其能大规模生产，菌种优选原核细胞，更优选大肠杆菌。
对于整个生产工艺，优选的方法如下菌种复苏、筛选→菌种扩增→发酵→诱导表达→收获菌体→菌体处理→超声上清液处理→超滤→层析纯化(第一、第二步)→样品检定→储存备用。
为提高菌密度和表达量，在菌种培养和菌体处理中优选使用葡萄糖浓度0-0.3％的培养基。另外，为获得较多菌体，增加培养基中的碳、氮源总量是有利的，例如可选择2×YT和LB及超级肉汤培养基。
根据本发明优选的纯化方法，发酵的菌体以pH 8.5 50mM Tris-HCl缓冲液进行悬浮。
实验结果证明，本发明方法得到的纯化产物中目的蛋白纯度IL-1ra的纯度可达到9 5％以上，等电点pI＝5.3±0.5，而生物学活性不低于1×105IU/mg。
利用本发明的方法对IL-1ra进行分离纯化的结果完全可与传统方法相比拟，但是操作过程却大大简化，并且该方法能够很好地重现。所以，本发明利用简单的方法替代繁琐的传统方法获得了意想不到的效果，可以说在蛋白的分离纯化工艺上克服了现有技术的偏见，为工业化大规模制备rhIL-1ra提供了良好的技术支持，对于其它的蛋白质纯化工艺提供新的思路。
实施例下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域熟知的常规条件操作。
一、纯化工艺(一)发酵培养基2×YT胰蛋白胨10.0g酵母提取物 10.0gNaCl5.0g
加去离子水至1000ml工艺参数生长温度30℃诱导温度42℃pH 7.2溶解氧 45％发酵工艺路线保藏菌种——单菌落——一级种子(F2)——二级种子(F3)培养——发酵——离心收集菌体。
菌种活化与扩大培养挑取一接种环保存菌种，划LA平板24～36小时，30℃培养生产单菌落。
F1发酵菌种挑取LA平板单一菌落，接入LA 2ml培养基中(含氨苄)30℃，培养箱过夜。
F2发酵菌种将F1接到50ml/500ml三角瓶，LB培养基中(含氨苄)30℃，200转/min摇荡培养，至O.D600×10达0.25～0.35时转入二级扩培。
F3发酵菌种将F2接到300ml/1L三角瓶，LA培养基中，30℃ 300rpm/min摇荡培养，O.D600×10达0.30～0.40，接种入发酵罐。
发酵罐发酵培养按1∶10比例将F3接种入罐，30℃培养至O.D600×10达0.30-0.40，升温诱导42℃保持4小时，压缩空气做气源，保持通气量1vvm，溶氧控制30-45％，诱导时pH7.0-7.2，诱导过程中，每隔1小时取样，测O.D600×10至最大，不再增长。补料速率在培养阶段控制在补料泵20％-40％，随发酵时间以10％增长，诱导阶段，补料速率控制在补料泵60-80％，在诱导阶段第一小时内补料速度最大。
检测1)测O.D600:使用“721”分光光度计，波长600nm；对照蒸馏水；样品发酵液稀释10倍。
2)菌体相对表达量将菌体蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(15％)，用考马斯亮蓝染色，常规脱色。用薄层扫描仪扫描，计算出目的蛋白占可溶性菌体蛋白的百分率。
(二)菌体处理1、上述过程的发酵液以10000rpm离心，弃上清，取菌体沉淀，称湿菌重，称重后菌体备用。
2、称重后菌体以pH8.5 50mM Tris·Hcl缓冲液按W/V＝1∶10比例悬浮。
3、超声处理菌体。
4、超声处理后菌液以10000rpm离心，弃沉淀取上清。
5、上清液以70KD超滤膜进行超滤，流速80-100ml/min，入口压力＜10psi，弃截流液，滤过液备用。
(三)液相层析纯化1、阴离子交换液相层析(1)层析介质的预处理及层析柱准备A、层析介质DEAE Fast FlowB、预处理方法a、将介质充分混匀b、根据所需柱床体积量取层析介质300ml。
c、以去离心水漂洗层析介质，将储存液中所含乙醇除净。
C、缓冲液准备A液pH 8.5 50mM Tris-HCl缓冲液；B液pH 6.8 20mM PB
C液2M NaCl，0.2N NaOH；D、层析柱准备(1)层析柱XK系列层析柱(Phacmecie公司)a将层析柱固定于Biohload支架上，各部分管路连接正确。
b将层析柱上口柱头旋开，下口关闭。
c将预处理层析介质一次性倾入层析柱内静置，直到层析介质完全沉淀。
d将层析柱上口旋紧，压杆下端与层析介质上界面刚刚接触。
e开放流出口，同时开启泵和流入口管路。以去离子水冲洗已装好的层析柱10个CV。
f以起始缓冲液(A液)冲洗层析柱10-15个CV。
(2)上样A、将进液管移至样品液(超滤流出液)储槽中。
B、检查系统各部连接无误后，设定流速30-40ml/min，UV检测灵敏度在0.01-0.1范围；记录低速0.1mm/min。
C、启动程序，将样品液加至层析柱上。
(3)洗涤A、上样完毕，将进液管移至起始缓冲液中。
B、按设定流速，以起始缓冲液(A液)冲洗已载有目的蛋白的层析柱，直至记录仪描记笔回至基线。
(4)洗脱A、设定在15-20个CV范围内，B液梯度由0％提高至80％。
B、按设定流速启动程序，使B液呈线性梯度上升。
C、当B液梯度为80％时，检测器显示流出液OD280升高，记录笔描记出一上升峰形。
D、收集此部分流出液，直至记录笔描记完整峰形，并回落至基线附近。
(5)层析介质的再生A、以2M NaCL冲洗层析柱5-10CV。
B、以2M NaCL 0.2N NaOH冲洗层析柱5-10CV。
C、以去离子水冲洗层析柱10-20CV。
D、以起始缓冲液冲洗层析柱10-15CV。
2、阳离子交换层析(1)层析介质的预处理及层析柱准备A、层析介质CM Fast FlowB、预处理方法a将介质充分混匀b根据所需柱床体积量取层析介质300ml。
c以去离心水漂洗层析介质，将储存液中所含乙醇除净。
C、缓冲液准备A液pH5.5 50mM HAc-NaAc缓冲液；B液2M NaCl，C液2M NaCl，0.2N NaOH；D、层析柱准备a.层析柱XK系列层析柱(Phacmecie公司)b.将层析柱固定于Biohload支架上，各部分管路连接正确。
c.将层析柱上口柱头旋开，下口关闭。
d.将预处理层析介质一次性倾入层析柱内静置，直到层析介质完全沉淀。
e.将层析柱上口旋紧，压杆下端与层析介质上界面刚刚接触。
f.开放流出口，同时开启泵和流入口管路，以去离子水冲洗已装好的层析柱10个CV。
g.以起始缓冲液冲洗层析柱10-15个CV。
(2)上样A、将进液管移至样品液(第一步层析纯化收集组份)储槽中。
B、检查系统各部连接无误后，设定流速30-40ml/min，UV检测灵敏度在0.01-0.1范围；记录低速0.1mm/min。
C、启动程序，将样品液加至层析柱上。
(3)洗涤A、上样完毕，将进液管移至起始缓冲液中。
B、按设定流速，以起始缓冲液冲洗已载有目的蛋白的层析柱，直至记录仪描记笔加至基线。
(4)洗脱A、设定在15-20个CV范围内，B液梯度由0％提高至80％。
B、按设定流速启动程序，使B液呈线性梯度上升。
C、当B液梯度为10％时，检测器显示流出液OD280升高，记录笔描记出一上升峰形。
D、收集此部分流出液，直至记录笔描记完整峰形，并回落至基线附近。
(5)层析介质的情况与再生A、以2M NaCl冲洗层析柱5-10CV。
B、以2M NaCl 0.2NnaOH冲液层析柱5-10CV。
C、以去离子水冲洗层析柱10-20CV。
D、以起始缓冲洗层析柱10-15CV。二、检测1、纯度SDS-PAGE 电泳结果中除rhIL-1ra外无明显杂蛋白出现，rhIL-1ra蛋白量为总蛋白量的97％。
HPLC法 结果判定rhIL-1ra峰面积大于97％。
2、等电点等电聚焦电泳主区带位于pI 5.1-5.33、生物学活性高于1×105IU/mg检定方法A.样品稀释将rhIL-1ra标准品及按照上述方法得到的待测样品用含10％FBS的1640培养液连续2倍、5倍稀释，加到已预先加入60μl完全1640培养液的96孔板中，每孔20μl，每稀释度3个复孔，另设两组阴性对照，细胞对照组和细胞加有丝分裂原对照组(ConA)，培养板置4℃放置待用。
B.效应细胞的制备a.将C57BL/6小鼠眼球取血处死，无菌摘取胸腺，在盛有RPMI1640培养液的无菌平皿中用注射器芯将胸腺挤压，通过200目的金属网，分离单个胸腺细胞。
b.用RPMI1640培养液1300rpm/5min洗涤细胞两次，用完全1640培养液悬浮细胞至1×107个/ml，内含ConA2.5μg/ml，迅速混匀，加入含样品的培养板中，每孔100μl。
c.在37℃ 5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养，30分钟后加入IL-1β(1ng/ml)，每孔加20μl，总体积200μl，继续培养72小时，在培养结束前6小时，每孔加MTT溶液(5mg/ml，溶于PBS中，滤过除菌，4℃避光保存)20μl，继续培养4-6小时。
d.离心培养板吸去培养液，每孔加100μl PBS缓冲液和100μl裂解液，让还原产物(formazan紫色结晶)充分溶解，置二氧化碳培养箱37℃放置12-24小时。
e.检测用酶联免疫检测仪以细胞加有丝分裂原对照组调零于570nm测OD值，计算活性单位。
结果计算以OD值为Y轴，以标准品和待测样品蛋白浓度为X轴，绘出增殖抑制曲线，找出标准品抑制达最大OD值50％反应所对应的蛋白稀释度(设为m)，再找出待测样品抑制达最大OD值50％反应所对应的蛋白稀释度(设为n)，按下式计算待测样品的活性单位样品活性单位(U/mg)＝m/n(标准品的活性单位(U/mg)
权利要求
1.重组人白细胞介素-1受体结抗剂的纯化方法，其特征在在于，将制备出的目的蛋白顺序进行阳离子交换液相层析和阴离子交换液相层析。
2.权利要求1所述的纯化方法，其中，阳离子交换液相层析过程的层析介质为DEAE Fast Ftow；使用的缓冲液包括A液pH 8.5 50mM Tris-HCl缓冲液B液pH 6.8 20mM PB上样完毕后，先以A液冲洗已载有目的蛋白的层析柱，然后采用B液进行梯度洗脱。
3.权利要求2所述的纯化方法，其中，B液的洗脱梯度为0％-80％。
4.权利要求1所述的纯化方法，其中阳离子交换液相层析过程的层析介质为CM Fast Ftow；使用的缓冲液包括A液pH 5.5 50mM HAc-NaAc缓冲液B液2M NaCl上样完毕后，先以A液冲洗已载有目的蛋白的层析柱，然后采用B液进行梯度洗脱。
5.权利要求4所述的纯化方法，其中，B液的洗脱梯度为0％-80％。
6.权利要求1所述的纯化方法，其还包括通过菌种培养和菌体处理过程制备目的蛋白的过程。
7.权利要求6所述的纯化方法，其中，在菌种培养和菌体处理中使用葡萄糖浓度0-0.3％的培养基。
8.权利要求2或6所述的纯化方法，其中，发酵的菌体以pH 8.5 50mMTris-HCl缓冲液进行悬浮。
全文摘要
本发明公开了一种分离纯化蛋白，尤其是重组人白细胞介素－1受体结抗剂的方法，采用二步液相层析法，首先进行阴离子交换液相层析，然后再进行阳离子交换层析。本发明利用简单的方法替代繁琐的传统方法获得了意想不到的效果，即，只使用简单的二步液相层析法就得到了高纯度，高活性的重组人白细胞介素－1受体拮抗剂，对于其它的蛋白质纯化工艺也提供了新的思路。
文档编号C07K1/00GK1472225SQ0212580
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月29日 优先权日2002年7月29日
发明者马大龙, 狄春辉, 朱仁英, 杨璐, 韩普 申请人:北京北医联合生物工程公司