一种在真核细胞中高效表达重组人白细胞介素12的方法

专利名称：一种在真核细胞中高效表达重组人白细胞介素12的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种提高重组人IL-12在真核细胞中表达强度的方法。
背景技术：
白细胞介素-12(IL-12)是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的多肽链组成，一条为35kDa(P35亚基)，另一条为40kDa(P40亚基)。P35亚基由多种细胞产生，包括T、B淋巴细胞、NK细胞和大单核细胞等，而P40链主要由激活的单核细胞和B细胞产生。P35和P40单独存在时均无任何IL-12的生物活性。
IL-12在细胞介导的免疫应答中是一种重要的调节因素，它作用于NK细胞和T淋巴细胞。
(1)IL-12是NK细胞强有力的刺激因子，它可通过NK细胞诱导γ-干扰素的复制，并与白细胞介素-2有较强的协同作用。另外，除了刺激产生γ-干扰素外，IL-12还可增强NK细胞的溶细胞活性，而且还是NK细胞的生长因子。
(2)IL-12刺激原初CD4+T细胞分化成TH1亚群，相应的IL-12和γ-干扰素的生产可控制TH1及TH2优势的T细胞的发展，这样有助于TH1分化优势，及对IL-4和IL-10的控制并提高TH2的分化。
(3)IL-12刺激CD8+T细胞分化为成熟细胞，功能性激活的CTL，由于这些效应，IL-12在治疗一些播散性肿瘤方面有潜在的作用。
IL-12能诱导NK细胞、T细胞等产生γ-干扰素，同时激活NK细胞和巨嗜细胞，增强其细胞杀伤活性，而且在γ-干扰素存在时显示阻碍肿瘤新生血管的作用。它在机体早期的非特异性免疫和随后的抗原特异性的适应性免疫过程中均扮演了极为重要的角色，它能显著杀死癌细胞。初步研究结果显示，重组人IL-12可以诱导全身性抗肿瘤免疫反应，从而抑制肿瘤生长或得到完全缓解。上述研究表明，IL-12是一种多功能的免疫调节因子，有可能成为治疗癌症的有效药物。
另外，IL-12是目前发现的极少数增强DNA疫苗诱导细胞免疫的良好佐剂中最好的，预计将来在DNA疫苗的研究上将发挥独特的作用。
综上所述，IL-12具有巨大的应用前景。
然而，在目前报道的利用真核细胞表达产生重组IL-12的方法中，重组IL-12的表达强度仍不令人满意。因此，本领域中迫切需要有一种提高重组IL-12在真核细胞中的表达强度的方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种在真核细胞中高效表达IL-12的方法，从而克服现有技术中表达强度不高的缺点，从而大大降低生产成本。
本发明提供了一种生产重组人白细胞介素-12的方法，该方法包括a)提供对应于P35亚基的核苷酸序列和对应于P40亚基的核苷酸序列，其中所述P35亚基具有完整的第一信号肽；b)将步骤a)所述核苷酸序列插入表达载体中；c)用步骤b)获得的表达载体转化真核细胞；d)在适合重组人IL-12表达的条件下，培养步骤c)所得的转染的真核细胞；e)从培养物中分离纯化得到白细胞介素-12。
在上述方法中，真核表达载体可以是pMT2，真核细胞可选自CHO细胞、Vero细胞和COS细胞。
在本发明的一个实施方案中，所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。在另一实施方案中，所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列是真核细胞所偏好的。在还有一个实施方案中，所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
本发明提供了一种能在真核细胞中高效表达重组人白介素-12的方法。与现有技术相比，本发明的方法可使P35亚基的表达提高大约8-17倍。由于P35亚基表达强度的提高，P35和P40两个亚基的表达量得到了平衡，从而使具有生物活性的IL-12的表达量得到显著提高。
下面将进一步详细描述本发明。
发明实施方式本发明提供了一种生产重组人白细胞介素-12的方法，该方法包括a)提供对应于P35亚基的核苷酸序列和对应于P40亚基的核苷酸序列，其中所述P35亚基具有完整的第一信号肽；b)将步骤a)所述核苷酸序列插入表达载体中；
c)用步骤b)获得的表达载体转化真核细胞；d)在适合重组人IL-12表达的条件下，培养步骤c)所得的转染的真核细胞；e)从培养物中分离纯化得到白细胞介素-12。
本文所用的术语“表达载体”通常指能在所选宿主细胞中复制的质粒或其它核酸分子。该表达载体可以自主复制，或可通过本领域熟知的方法插入宿主细胞的基因组中而进行复制。自主复制的载体具有在所选宿主细胞内起作用的复制起点或自主复制序列。通常，希望一个载体可用于多种宿主细胞内，例如在大肠杆菌中用于克隆和构建，在哺乳动物细胞用于表达。在本发明的一个实例中，所用的真核表达载体为pMT2(其图谱见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。然而，本发明也可采用本领域技术人员熟知的其它的合适载体。
在本发明中，通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》，Academic Press，Kruse and Patterson编辑(1973)，该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。另外，宿主细胞系还可包括以下生物体，如细菌(如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)、酵母、丝状真菌、植物细胞或昆虫细胞。
本文所用的术语“转化”是指用熟知的方法将含有感兴趣的核酸的载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括电穿孔；采用氯化钙、氯化铷磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。在本发明的一个实例中，转化方法是脂转染。
如上所述，重组人白介素-12是一种70kDa的异二聚体，它由P35亚基和P40亚基组成。P35和P40基因的核苷酸序列分别显示在序列表SEQ ID NO1和SEQ IDNO2中。P35亚基的氨基酸序列显示在序列表SEQ ID NO8中。
研究表明，P35亚基只有与P40亚基形成二聚体后才能有效地分泌到细胞外。因此，本发明者将这两个基因分别插入到杆状病毒感染最晚期的多角体蛋白(polyhedrin)启动子和p10启动子后面，使这两个基因在量的方面尽可能有一均衡的比例。ELISA和Western印迹结果表明，杆状病毒可以使两个不同的基因在同一载体上得到有效的表达，并且能够正确地折叠、形成有生物活性的二聚体。
Western印迹结果还表明，P40亚基单体的分泌量远远高于P35亚基。这一结果一方面支持P35亚基只有与P40亚基结合后才能分泌出细胞的观点，另一方面表明重组人IL-12在真核细胞中最终表达量的高低主要取决于P35亚基的表达量。由此可见，具有生物活性的IL-12的表达量主要取决于P35亚基的表达量。因此，欲提高IL-12的表达量，其一种可行的途径是提高P35亚基的表达量。
在P35基因中，有两个起始密码子，其中第二个起始密码子位于第一个起始密码子后面的第35位。由于这两个起始密码子的存在，该基因可以转录出两种不同的mRNA产物。碰巧的是，这两个起始密码子是“嵌套”的，即具有相同的阅读框架，第二个阅读框架是第一个阅读框架的一部分，因此这两种起始方式的编码产物的成熟蛋白结构是相同的。P35结构基因编码产物的第一个信号肽由第1～34个氨基酸组成，第二个信号肽由第35～37位氨基酸组成。与P35亚基第一个信号肽的氨基酸序列对应的核苷酸序列为SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的核苷酸1-102。
目前报道的利用真核系统表达IL-12的研究均是从第二个信号肽开始的。然而，本发明者发现，在分子克隆中保留第一个信号肽序列可以使P35的表达量明显提高。保留编码第一个信号肽序列还可以增加P35mRNA分子的稳定性，从而提高其编码产物的产量。另外，本发明者还参照哺乳动物对密码子的偏爱性对编码第一信号肽的核苷酸序列作了基因工程改造，从而使该基因更能适合在真核细胞中表达，P35的表达量进一步得到提高。经基因工程改造后的核苷酸序列显示在SEQ ID NO3中，其中核苷酸1-102对应于P35亚基的第一信号肽序列。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。
实施例1基因的扩增A.引物设计1)P35的扩增引物正向引物5’ctcctgcagatgtggccccctggtcag-3’(SEQ ID NO4)，其中ctc为保护碱基，下划线部分为向表达载体pMSG(购自Pharmacia)克隆时的切点(Pst I)。
反向引物5’-gcagaattcttaggaagcattcagatagctc-3’(SEQ ID NO5)，其中gca为保护碱基，下划线部分为向上述表达载体克隆时的切点(Eco RI)。
2)P40的引物设计正向引物5’-ctgctgcagatgtggccccctggtcag-3’(SEQ ID NO6)，其中ctc为保护碱基，下划线部分为向表达载体pMSG(Pharmacia)克隆时的切点(Pst I)。
反向引物5’-gcagaattcttaggaagcattcagatagctc-3’(SEQ ID NO7)，其中gca为保护碱基，下划线部分为向上述表达载体克隆时的切点(Eco RI)。
合成所述引物并进行PAGE纯化。
B.NC-37淋巴母细胞总RNA的提取、纯化与反转录取5毫升1×106细胞/毫升的NC-37淋巴母细胞培养液，加入佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate)和钙离子载体(calcium ionophor A23187)至最终浓度为5mM和7.5mM，37℃5％CO2培养箱中培养12小时，诱导人表达IL-12的表达。
取约2×106个上述诱导后的淋巴母细胞培养液，6000rpm离心10分钟收集细胞，加入约1毫升Trizol试剂(购自Invitrogene公司)，按照厂家说明提取纯化总RNA。
纯化的RNA经1％琼脂糖电泳鉴定，完整性良好，可用于反转录。
将上述纯化的总RNA用反转录试剂盒(购自MBI)进行反转录，其反转录引物为oligo-(dT)18，操作按照厂家的说明书进行。电泳检查证明，获得的cDNA完整性良好。
C.P35和P40基因的扩增P35和P40的PCR反应体系均为50μL，反应体系组成1×PCR反应缓冲液，forward和backward引物浓度均为100pmol/L，镁离子1.5mmol/L，模板DNA浓度为0.1mmol/L，含3U Pfu DNA聚合酶。上述每管50μL的反应体系共进行5只管子，以获得足量的扩增产物。
P35和P40的PCR反应热循环均采用以下条件预变性94℃2分钟；主循环94℃1分钟，58℃1分钟，72℃2.5分钟，共30个循环；后延伸72℃5分钟。
以上循环完成后，在1％琼脂糖电泳上进行鉴定。在P35的扩增产物中发现有一个分子大小约750bp的单一条带，与预期的分子量751bp相符。在P40的扩增产物中发现有一个分子大小约为950-1000bp的单一条带，与P40的预期的985bp相符。用胶回收试剂盒(Bio101)对该片段回收，操作过程按照厂家说明进行。得纯化的DNA约各3微克。
实施例2基因的克隆、鉴定与测序将上述获得的纯化的扩增产物插入到pGEM-T载体(Promega产品)上。操作步骤按照厂家的说明进行，获得重组DNA。
用常规方法将上述重组DNA转化大肠杆菌DH5α菌株，经蓝/白斑筛选获得P35的阳性克隆19个，P40的阳性克隆23个。P35和P40各酶切鉴定5个克隆后分别确认2个和3个克隆带有目的插入片段。
在ABI377全自动测序仪上对上述鉴定出的P35和P40的阳性克隆各2个进行双向测序。测序结果如序列表中SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。
实施例3 P35亚基信号肽I和II的表达与P35表达量之间的关系Western印迹研究已经证明，P40单体的分泌量远远高于P35，具有生物活性的IL-12的表达量主要取决于P35的表达量。因此，欲提高IL-12的表达量，一种可行的途径是提高P35的表达量。
由于人们认为P35cDNA和一些细胞因子基因序列一样，其序列本身可能就是调节其表达的调控元件，如何调整P35cDNA序列以增加P35的表达是提高最终IL-12产量的关键所在。
用分析软件DNAstar3.10版对P35结构基因及其翻译产物的结构特点进行分析，结果发现其编码的产物包含有两个信号肽(I和II)。第一个信号肽由第1～34个氨基酸组成，第二个信号肽由第35～37位氨基酸组成。
本发明的研究证明，保留两个信号肽序列可以使P35的表达量明显提高，最高可以提高8倍(结果见下表1)。而且还发现，保留编码第一个信号肽序列可以增加P35mRNA分子的稳定性，从而提高其编码产物的产量。
表1.信号肽组成与P35表达强度的关系。

从表1可以看出，第一信号肽的存在可以明显提高P35的表达量，这对协调P35和P40两个亚基在数量上的平衡有着重要意义。
实施例4 P35的基因工程改造为了进一步提高P35基因的表达强度，在实施例3的基础上，在保持第一信号肽氨基酸序列不变的前提下，本发明者又对P35基因第一信号肽的核苷酸序列参照哺乳动物对密码子使用的偏爱性进行了基因工程改造，以使该基因更能适合在CHO等真核细胞中表达。设计的该段DNA编码序列如下5’-atg tgg cca cct gga tca gca tcg cag cct cca ccg tca cct gca gct gcc act gga ctc cac cctgcg gca cga cct gtg tcc ctg cag tgc cgt cta agc-3’ (SEQ ID NO9)利用本领域已知的技术，合成上述DNA片段，并用该片段取代P35基因中的相应片段(即核苷酸1-102)。然后，将经改造的P35基因(其核苷酸序列见SEQ ID NO3)插入到克隆载体上并进行测序。从6个克隆中挑选出了一个完全正确的克隆，将该克隆记作P35(I+II)M。
实施例5真核表达载体的构建与CHO细胞的转染P35(I+II)、P35(I+II)M和P35(II)表达载体的构建将带有两个完整信号肽序列的P35cDNA(I+II)、P35(I+II)M和只带有第二个信号肽编码区的P35 cDNA(II)插入到真核表达载体pMT2(其图谱见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》，1989)上，将载体和上述cDNA经Pst I(对P35(I+II)和P35(I+II)M进行不完全降解)和Eco RI双酶切后进行连接，具体操作程序参照《分子克隆实验指南》中描述的方法进行。
将上述重组DNA分子按照常规方法转化大肠杆菌DH5α菌株，经蓝白斑筛选得到6个P35(I+II)候选阳性克隆和5个P35(II)候选克隆。经酶切验证后各取一个克隆进行测序，获得序列完全正确的克隆pMT2/P35(I+II)、pMT2/P35(I+II)M和pMT2/P35(II)。
P40表达载体的构建将实施例2中的P40cDNA克隆插入到真核表达载体pMT2上。具体克隆方法同上。经蓝白斑筛选和测序后得到了序列完全正确的克隆pMT2/P40。
高纯质粒DNA的纯化取分别带有pMT2/P35(I+II)、pMT2/P35(I+II)M和pMT2/P35(II)以及pMT2/40质粒的大肠杆菌菌株，分别接种于500ml加入了氨苄青霉素的2xYT液体培养基，37℃260rpm震荡培养16小时后，用Qiagen公司的超纯质粒纯化试剂盒(Ultrapure PlasmidPurification Kit)抽提质粒DNA，抽提过程按照厂家提供的说明书进行。
CHO细胞的转染与筛选采用脂质体法对CHO细胞进行转染，转染试剂盒购自Invitrogene公司。转染时取上述的纯化的pMT2/P35(I+II)(0.95ug/ul)、pMT2/P35(I+II)M(0.95ug/ul)和pMT2/P35(II)(0.95ug/ul)各100微克，分别与100微克pMT2/40(1.0ug/ul)质粒DNA，充分混合后作为转染的DNA样品共转染CHO细胞。转染操作程序按照厂家的说明书进行。
转染后的CHO细胞经连续3个月的氨甲喋呤(MTX)筛选，其浓度从0.05uM到10uM，每两周增加一次浓度，每次MTX的用量约为前一次的2倍。细胞培养按照常规进行，培养基为15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37度5％CO2培养箱中培养。然后按照常规极度稀释法进行单克隆化。应用ELISA方法分别检测其IL-12的生物活性，总共得到189个有IL-12表达的单克隆。经ELISA法，上述部分克隆的IL-12表达强度进行了研究，结果显示在下表2中表2 P35亚基信号肽对IL-12表达水平的影响

从表2的结果可以看出，增加第一信号肽编码序列使得IL-12的表达水平提高幅度高达6倍。而对该增加的信号肽编码序列进行适当改造后，IL-12的表达水平进一步得到提高，为仅带第二信号肽时的18.9倍。
尽管本发明出于描述目的作了详细描述，但是应当理解，这些详细描述只是为了这个目的，本领域技术人员能在不脱离下列权利要求确定的本发明的精神和范围内对其作各种变化。
序列表<110>上海张江生物技术有限公司<120>一种在真核细胞中高效表达重组人白细胞介素12的方法<130>014883<160>9<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>761<212>DNA<213>人<400>1atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgvgcagc 120ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttac 360cattggaatt aaccaagaat gagagttgcc taaattccag agagacctct ttcataacta 420atgggagttg cctggcctcc agaaagacct cttttatgat ggccctgtgc cttagtagta 480tttatgaaga cttgaagatg taccaggtgg agttcaagac catgaatgca aagcttctga 540tggatcctaa gaggcagatc tttctagatc aaaacatgct ggcagttatt gatgagctga 600tgcaggccct gaatttcaac agtgagactg tgccacaaaa atcctccctt gaagaaccgg 660atttttataa aactaaaatc aagctctgca tacttcttca tgctttcaga attcgggcag 720tgactattga tagagtgatg agctatctga atgcttccta a 761<210>2<211>985<212>DNA<213>人<400>2atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccttcacaag ctaagtatga 660aaactacacc agcagcttct tcatcaggga catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt 720gcagctgaag ccattaaaga attctcggca ggtggaggtc agctgggagt accctgacac 780ctggagtact ccacattcct acttctccct gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag 840caagagagaa aagaaagata gagtcttcac ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg 900caaaaatgcc agcattagcg tgcgggccca ggaccgctac tatagctcat cttggagcga 985<210>3<211>761<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<220><221>misc feature<223>p35基编码序列(具有改造过的第一信号肽编码序列)<400>3atgtggccac ctggatcagc atcgcagcct ccaccgtcac ctgcagctgc cactggactc 60caccctgcgg cacgacctgt gtccctgcag tgccgtctaa gcatgtgtcc agcgvgcagc 120ctcctccttg tggctaccct ggtcctcctg gaccacctca gtttggccag aaacctcccc 180gtggccactc cagacccagg aatgttccca tgccttcacc actcccaaaa cctgctgagg 240gccgtcagca acatgctcca gaaggccaga caaactctag aattttaccc ttgcacttct 300gaagagattg atcatgaaga tatcacaaaa gataaaacca gcacagtgga ggcctgttac 360cattggaatt aaccaagaat gagagttgcc taaattccag agagacctct ttcataacta 420atgggagttg cctggcctcc agaaagacct cttttatgat ggccctgtgc cttagtagta 480tttatgaaga cttgaagatg taccaggtgg agttcaagac catgaatgca aagcttctga 540tggatcctaa gaggcagatc tttctagatc aaaacatgct ggcagttatt gatgagctga 600tgcaggccct gaatttcaac agtgagactg tgccacaaaa atcctccctt gaagaaccgg 660atttttataa aactaaaatc aagctctgca tacttcttca tgctttcaga attcgggcag 720tgactattga tagagtgatg agctatctga atgcttccta a 761<210>4<211>27<212>DNA<213>引物<400>4ctcctgcaga tgtggccccc tggtcag27<210>5<211>31<212>DNA<213>引物<400>5gcagaattct taggaagcat tcagatagct c 31<210>6<211>27<212>DNA<213>引物<400>6ctgctgcaga tgtggccccc tggtcag27<210>7<211>31<212>DNA<213>引物<400>7gcagaattct taggaagcat tcagatagct c 31<210>8<211>253<212>PRT<213>人<400>8Met Trp Pro Pro Gly Ser Ala Ser Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ala1 5 10 15Ala Thr Gly Leu His Pro Ala Ala Arg Pro Val Ser Leu Gln Cys Arg20 25 30Leu Ser Met Cys Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val35 40 45Leu Leu Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro50 55 60Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg65 70 75 80Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr85 90 95Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys100 105 110Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu115 120 125Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys130 135 140Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser145 150 155 160Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn165 170 175Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn180 185 190Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser195 200 205Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys210 215220Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala225 230 235 240Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser245 250<210>9<211>102<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<220><221>misc_feature<223>改造过的第一信号肽编码序列<400>9atgtggccac ctggatcagc atcgcagcct ccaccgtcac ctgcagctgc cactggactc 60caccctgcgg cacgacctgt gtccctgcag tgccgtctaa gc 10权利要求
1.一种生产重组人白细胞介素-12的方法，该方法包括a)提供对应于P35亚基的核苷酸序列和对应于P40亚基的核苷酸序列，其中所述P35亚基具有完整的第一信号肽；b)将步骤a)所述核苷酸序列插入表达载体中；c)用步骤b)获得的表达载体转化真核细胞；d)在适合重组人IL-12表达的条件下，培养步骤c)所得的转染的真核细胞；e)从培养物中分离纯化得到白细胞介素-12。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核表达载体是pMT2。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述真核细胞选自CHO细胞、Vero细胞和COS细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列是真核细胞所偏好的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述真核细胞选自CHO细胞、Vero细胞和COS细胞。
全文摘要
一种生产重组人IL－12的方法，该方法包括a)提供对应于具有第一信号肽的P35亚基的核苷酸序列和对应于P40亚基的核苷酸序列；b)将步骤a)所述核苷酸序列插入表达载体中；c)用步骤b)获得的表达载体转化真核细胞；d)在适合重组人IL－12表达的条件下，培养步骤c)所得的转染的真核细胞。该方法通过提高P35亚基的表达强度使P35和P40两个亚基的表达量得到了平衡，从而提高了具有生物活性的IL－12的表达量。
文档编号C07K14/435GK1408727SQ0112692
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月29日 优先权日2001年9月29日
发明者万国光, 李春澍 申请人:上海中信国健药业有限公司