专利名称：：调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列与应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体涉及调控细胞程序性死亡的花生衰老基因AhSAG及编码序列与应用。
背景技术：
：在植物中，细胞死亡是一种常见的现象，是高度专一的细胞发育过程中的一部分。在这个过程中，植物细胞受到外在和内在信息(外在环境、发育信号、代谢环境等)的刺激，改变细胞命运，引起细胞死亡。细胞死亡表现为两种类型细胞坏死(Cellnecrosis)和细胞程序性死亡(PCD)。细胞坏死，通常是由于偶然的外界因素如受热或药物等极度刺激引起的溶酶体颗粒的释放，导致细胞自溶死亡，是一种非正常的死亡。PCD是指受基因编码指令调控的一系列有序的分子事件，是一种主动的、生理性的细胞死亡过程。迄今为止，已在高等植物中发现了许多P⑶事件，包括植物发育过程中的P⑶和环境诱导P⑶,主要有植物病原物互作引发的过敏反应(hypersensitiveresponse,HR)、根皮层细胞死亡、珠心细胞退化、糊粉层细胞退化、通气组织形成、体细胞胚胎发生、根冠细胞死亡、单性花形成、大孢子消失、花药壁开裂等。植物PCD与动物细胞凋亡相似细胞膜保持完整性和收缩，类半胱氨酸蛋白酶(Cysteine-containingAspartate-specificproteases,caspasess)参与，DNA分割成核仁小体梯状等。但由于动植物在细胞形态及生理功能上存在显著差别，所以植物PCD与动物细胞凋亡的差异较大。在植物中，液泡在PCD中起重要作用，一般采取自噬的方式，但动物细胞凋亡最为典型的特征是形成凋亡小体，并被其它细胞吞噬。细胞衰老是一种P⑶现象，指细胞对环境变化的适应力以及维持细胞内环境稳定和合成能力的降低，如在亚细胞结构上叶绿体和其他细胞器的有序衰退；代谢水平上细胞内大分子的降解、动员；基因水平上衰老相关基因SAGs的激活和表达。衰老很大程度上被认为是植物生长发育的最后调节因素，衰老的快慢直接影响到植物生长，影响农作物产量，叶片早衰被认为是农作物低产的重要原因。紫外、温度、干旱、病菌等逆境胁迫可促进植物发生早衰，从而引起植物体内能源的再分配(KimHJ.2007.Molecularregulationofleafsenescence.InsenescenceProcessesinPlants,231—255.LimP0.2007.Leafsenescence.AnnuRevPlantBiology58:115_136)。因此,推测逆境胁迫与衰老密切相关。与衰老有关基因包括了衰老上调基因和衰老下调基因。衰老上调基因或称衰老相关基因(senescence-associatedgenes,SAGs)是指一些未曾在功能叶片中表达或低水平表达的基因在衰老期间被激活，mRNA水平随叶片衰老而提高，即表达上调。衰老下调基因是指衰老过程中，受到抑制而低水平表达，甚至不表达，相应mRNA水平下降的一类基因。采用差异筛选和差减杂交检测绿叶和衰老叶片的mRNA构建cDNA文库，发现叶片RNA总量下降，而某些基因的表达量反而逐渐升高(刘莉.2008.水稻叶片衰老特异性启动子的克隆和利用及剑叶早期衰老上升表达基因的鉴定.[学位论文].广州华南农业大学)。在模式植物拟南芥的全基因组范围内鉴定了大量SAG，用包含24，000个基因的Affymetrix芯片杂交拟南芥衰老时期转录体，发现其中约800个基因呈上升、表达(GepsteinS,SabehiG,CarpMJ.2003.Large-scaleidentificationofleafsenescence-associatedgenes.PlantJournal36629~642；AnderssonA,KeskitaloJ,SjodinA..2004.Atranscriptionaltimetableofautumnsenescence.GenomeBiology5R24；LinJF,ffuSH.2004.MoleculareventsinsenescencingArabidopsisleaves.PlantJournal39612-638；Buchanan-ffollastonV,PageT,HarrisonE.2005.Comparativetranscriptomeanalysisrevealssignificantdifferencesingeneexpressionandsignalingpathwaysbetweendevelopmentalanddark/starvation-inducedsenescenceinArabidopsis.PlantJournal42(4):567_85;vanderGraffE,SchwackeR.2006.TranscriptionanalysisofArabidopsismembranetransportersandhormonepathwaysduringdevelopmentalandinducedleafsenescence.PlantPhysiology141:776_792;GuoF,GrawfordNM.2005.Arabidopsisnitricoxidesynthaselistargetedtomotochondriaandprotectsagainstoxidativedamageanddark-inducedsenescence.PlantCell17:3436_3450)。Buchanan-Wollaston等用基因芯片大规模比较了拟南芥叶片自然衰老和饥饿诱发悬浮细胞PCD的表达情况，发现827个自然衰老上升的基因中仅有326个同时是在悬浮细胞中的PCD增强表达(Buchanan-WollastonV,PageT,HarrisonE.2005.Comparativetranscriptomeanalysisrevealssignificantdifferencesingeneexpressionandsignalingpathwaysbetweendevelopmentalanddark/starvation-inducedsenescenceinArabidopsis.PlantJournal42(4):567_85)。推测衰老细胞中细胞死亡包含的PCD过程与植物生长发育过程中的其他类型PCD交错相连。目前未见花生衰老基因AhSAG公布过。
发明内容本发明的目的为了调控植物细胞对环境变化的适应力以及维持细胞内环境稳定和合成能力，提供一种调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列与应用。本发明是这样实现的一种调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列，从花生根尖提取RNA得到衰老基因AhSAG，其ORF的碱基序列为474bp，编码157aa的cDNA序列，其碱基序列如SEQIDNO.I所示。SEQIDN0.I为^tgIataggaagagccgacatcgaaggatcaaamgcaacgtcgctatgaacgcttggctg60CCACAAGCCAGTTATCCCTGTGGTAACTTTTCTGACACCTCTAGCTTCAAATTCCGAAGG120TCTAAAGGATCGTTAGGCCACGCTTTCACGGTTCGTATTCGTACTGGAAATCAGAATCAA180ACGAGCTTTTACCCTTCTGTTCCACACGAGATTTCTGTTCTCGTTGAGCTCATCTTAGGA240CACCTGCGTTATCTTTTAACAGATGTGCCGCCCCAGCCAAACTCCCCACCTGACAATGTC300TTCCGCCCGGATCGACCGGCCGAAGCCAGCCTTGGGTCCAAAAAGAGGGGCAATGCCCCG360CCTCCGATTCACGGAATAAGTAAAATAACGTTAAAAGTAGTGGTATTTCACTTTCGCCGT420TTCCGGCTCCCACTTATCCTACACCTCTCAAGTCATTTCACAAAGTCGGAC474所述的AhSAG来源于铝诱导花生根尖发生细胞程序性死亡的花生根尖分生组织，AhSAG的编码氨基酸列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2为MIGRADIEGSKSNVAMNAffLPQASYPCGNFSDTSSFKFRRSKGSLGHAFTVRIRTGNQNQ60TSFYPSVPHEISVLVELILGHLRYLLTDVPPQPNSPPDNVFRPDRPAEASLGSKKRGNAP120PPIHGISKITLKVVVFHFRRFRLPLILHLSSHFTKSD157所述的AhSAG是衰老诱导增强型基因，在浓度小于20iimol/LAl处理时，AhSAG基因在花生耐铝性品种和铝敏感品种中的表达很低；浓度在20lOOiimol/LAl处理时，AhSAG基因表达量显著升高，铝敏感品种表达量高于耐铝性品种表达量；在浓度100400umol/LAl处理时，AhSAG超表达，耐铝性品种和铝敏感品种均出现细胞程序性死亡现象，促进植物早衰。本发明试验中的花生耐铝品种99-1507和铝敏感品种中花2号，是根据发明人在2008年3月在《中国油料作物学报》发表的《铝对花生根尖细胞形态结构的影响》中的试验方案获得。一种包含调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码蛋白序列的重组表达载体，是通过将AhSAG基因导入载体pBI121-GFP得到重组表达载体。所述重组表达载体为正义表达载体或反义表达载体，是利用正义引物或反义引物通过PCR扩增基因AhSAG，然后克隆到载体pTG19-T上，经过酶切，然后导入载体PB1121-GFP中而得到，其作用于植物而得到的正义植物表达载体PB1121-GFP-AhSAG，反义植物表达载体pBI121-GFP-anti-AhSAG，经验证序列为正确，用于植物遗传转化，进行AhSAG基因功能鉴定。所述的正义引物是上游GCTCTAGAATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGXbaI位点下游TGCGGATCCCTAGTCCGACTTTGTGAAATGACBamHI位点所述的反义引物是上游TTGCGGATCCATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGBamHI位点下游GGCGTCTAGACTAGTCCGACTTTGTGAAATGACXbaI位点。一种包含调控细胞程序性死亡的花生衰老基因编码序列的重组表达载体的重组菌，所述的重组菌是通过正义植物表达载体和反义植物表达载体导入根癌农杆菌菌株EHA105得到，在异源真核系统中实现功能性表达。一种重组菌的转基因植株的应用，所述转基因植株是将重组的含GFP(绿色荧光蛋白)的正义和反义花生衰老基因AhSAG导入烟草中而得到烟草转基因植株。烟草转基因植株的测定，是通过荧光显微镜观察转化烟草的绿色荧光蛋白基因的表达，确定AhSAG在烟草中的表达和定位，在幼嫩的根尖、根的中柱和茎的形成层组织里表达的比较多，而且只在细胞壁和细胞膜中表达。所述烟草转基因植株铝处理下GFP(绿色荧光蛋白)表达，是铝处理诱导了花生衰老基因AhSAG的表达，铝浓度越高，衰老基因表达越强烈，且在相同的铝浓度下转正义基因的烟草比转反义基因烟草的表达要多，说明铝胁迫下，烟草根尖正义衰老基因表达增强，而衰老基因的表达加快根尖衰老，产生细胞程序性死亡。本发明的有益效果本发明的调控细胞程序性死亡的花生衰老基因AhSAG，提供一种有助于调控植物细胞对环境变化的适应力以及维持细胞内环境稳定和合成能力的方法，为植物增产增收创造条件。图I:为AhSAG基因ORF的碱基序列图；图2:为AhSAG基因ORF的蛋白氨基酸序列图；图3:为PCR扩增AhSAG基因中间片断电泳图谱；M为033Imaker，I为阴性对照，2为AhSAG中间片段；图4:为PCR扩增AhSAG基因3’race电泳图谱；MS0331maker，I为AhSAG3’race，2为阴性对照；图5:为PCR扩增AhSAG基因5’race电泳图谱；M为0331maker，I为其它的实验图片，2为AhSAG5，race；图6:为PCR扩增AhSAG基因全长cDNA电泳图谱；M为033Imaker，I为阴性对照，2为阴性对照，3为AhSAG全长基因；图7:为AhSAG在NCBI上氨基酸序列同源性分析；图8:为正义植物表达载体pBI121-GFP-AhSAG和反义植物表达载体pBI121-GFP-anti-AhSAG的酶切验证；M为Maker，I为pBI121-GFP_AhSAG/BamHI和XbaI,2为pBI121-GFP-anti-AhSAG/BamHI和XbaII;图9:为AhSAG基因在不同铝处理条件下的表达差异图；图10:为转AhSAG基因烟草形态，另提供其彩图为实质审查参考资料；A为未转基因的烟草，B为转反义AhSAG烟草，C为转正义AhSAG烟草；图11:为转AhSAG正反义基因烟草植株的PCR检测电泳图谱；M为MakerDL-2000，I为阴性对照，2-3为EHA105/pBI121-GFP_AhSAG，4-5为EHA105/pBI121-GFP-anti-AhSAG.；图12:为转基因烟草中AhSAG基因的荧光定位图谱;A为未转基因烟草的根尖，B为转正义AhSAG基因烟草的根尖，C为转反义AhSAG基因烟草的根尖，D为未转基因烟草嫩叶叶表皮细胞荧光图，E为转正义AhSAG基因烟草嫩叶表皮细胞荧光图，F为转反义AhSAG基因烟草嫩叶表皮细胞荧光图；图13:为转基因烟草根尖细胞在铝处理下GFP表达；A、E为未转基因烟草的根尖荧光图，B-D为转正义AhSAG基因烟草根尖细胞在不同的铝浓度下GFP表达，F-H转反义AhSAG基因烟草根尖细胞在不同的铝浓度下GFP表达，B、F为30iimol/LAlCl3，C、G为90umol/LAlCl3，D、H为150umol/LAlCl3(均为pH4.24.3处理24h)。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实施方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施准备I、所用花生品种耐招花生品种99-1507和招敏感品种中花2号。2、将供试花生种子置于粗沙中26°C催芽4d，催好芽的花生去掉种皮，Hoagland营养液培养，每2d更换一次营养液。花生幼苗抽出第二片真叶后，在含有0.5mmol/L的CaCl2(pH4.24.3)的溶液中预处理24h。3、选择0(阴性对照)、20(低浓度处理，两者均不发生PCD)、100(只有中花2号发生PCD),400umoI/L铝处理(两者均发生PCD)处理4d，用DNALadder和TUNEL来检验PCD发生情况。4、研究中使用到的菌株、质粒见表I。表I:本工作中使用的质粒和菌株权利要求1.一种调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列，其特征在于从花生根尖提取RNA得到衰老基因其ORF编码序列为474bp，编码157aa的cDNA序列，其碱基序列如SEQIDNO.I所示。2.根据权利要求I所述的调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列，其特征在于所述来源于铝诱导花生根尖发生细胞程序性死亡的花生根尖分生组织。3.根据权利要求I所述的调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列，其特征在于所述的编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求I或3所述的调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列，其特征在于所述是衰老诱导增强型基因，在浓度小于20μmol/LAl处理时基因在花生耐铝性品种和铝敏感品种中的表达很低；浓度在2(Γ100μmol/LAl处理时，AhSAG基因表达量显著升高，铝敏感品种表达量高于耐铝性品种表达量；在浓度lOOlOOymol/LAl处理时，AhSAG超表达，耐铝性品种和铝敏感品种均出现细胞程序性死亡现象，促进植物早衰。5.一种包含权利要求I或3所述的调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码蛋白序列的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是通过将基因导入载体PBI121-GFP得到。6.根据权利要求5所述的包含调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为正义载体或反义载体，是利用正义引物或反义引物通过PCR扩增基因然后克隆到载体PTG19-T上，经过酶切后导入载体PBI121-GFP中而得到，用于植物的正义植物表达载体pBI121-GFPjAS^，反义植物表达载体pBI121-GFP-a/ii经验证序列正确，用于植物遗传转化，进行基因功能鉴定;所述的正义引物是上游GCTCTAGAATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGXbaI位点下游TGCGGATCCCTAGTCCGACTTTGTGAAATGACBam^I位点所述的反义引物是上游TTGCGGATCCATGATAGGAAGAGCCGACATCGAAGGBamHI位点下游GGCGTCTAGACTAGTCCGACTTTGTGAAATGACXbaI位点。7.一种包含权利要求5或6所述的调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列的重组表达载体的重组菌，其特征在于所述重组菌是通过正义植物表达载体和反义植物表达载体导入根癌农杆菌菌株EHA105得到，在异源真核系统中实现功能性表达。8.一种包含权利要求7所述的重组菌的转基因植株的应用，其特征在于所述转基因植株是将重组的含GFP的正义和反义花生衰老基因导入烟草中而得到烟草转基因植株。9.根据权利要求8所述的转基因植株的应用，其特征在于所述烟草转基因植株的测定是通过荧光显微镜观察转化烟草的绿色荧光蛋白基因的表达，确定在烟草中的表达和定位，在幼嫩的根尖、根的中柱和茎的形成层组织里表达的比较多，而且只在细胞壁和细胞膜中表达。10.根据权利要求8所述的转基因植株的应用，其特征在于所述烟草转基因植株铝处理下GFP表达，是铝处理诱导花生衰老基因AASAG的表达，铝浓度越高表达越强烈，且在相同的铝浓度下，转正义基因的烟草比转反义基因烟草的表达要多，说明铝胁迫下，烟草根尖正义衰老基因表达增强，而衰老基因的表达加快根尖衰老，产生细胞程序性死亡。全文摘要本发明公开了一种调控细胞程序性死亡的花生衰老基因及编码序列与应用，从花生根尖提取RNA，克隆到花生衰老基因AhSAG，其ORF为编码序列474bp，编码157aa的cDNA序列；AhSAG来源于铝诱导花生根尖发生细胞程序性死亡的花生根尖分生组织，它是衰老诱导增强型基因，诱导激活促进植物早衰。本发明提供的花生衰老基因可以在烟草中表达，可用于调控植物细胞对环境变化的适应力以及维持细胞内环境稳定和合成能力。文档编号C07K14/415GK102660555SQ20121013454公开日2012年9月12日申请日期2012年5月3日优先权日2012年5月3日发明者何虎翼,何龙飞,王天菊,詹洁申请人:广西大学